Elisa

[Nguyễn Ngọc Lương]

Mình đang có vấn đề như thế này:
Mình muốn định lượng protein của mình qua các bước tinh sạch. Nhưng protein của mình không phải enzyme nên mình định làm bằng ELISA.
Mình hình dung sẽ xài direct ELISA: coat protein lên giếng và detect bằng antibody
Nhưng nghe nói dùng protein thô thì sẽ có vấn đề vì các protein khác sẽ cạnh tranh với protein cuả mình để coat lên giếng.
Trong direct ELISA protocol có nói antigen chỉ cần chiếm 3% trong sample là OK. Mình ước đoán protein của mình chiếm khoảng 3-5% total protein. Vậy mình có xài protein thô được không? Có ai từng làm cái này chưa?

Có người gợi ý competitive direct ELISA. Mình thấy có vẻ nhiều bước hơn nhưng phù hợp hơn trong trường hợp này. Nhưng mình muốn xem phương pháp đơn giản hơn kia thế nào đã.
Tái bút; mình chỉ có 1 antibody nên không xài sandwich được.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Liệu có thể dùng western blot không bác Lương nhỉ?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Western blot chỉ là qualitative, sách bảo thế mà làm thí nghiệm cũng thấy thế.
Nhiều khi rất nhiều protein băng vẫn mờ mịt.
ELISA là đúng cửa, nhưng hình như một số người quên cái chuyện nồng độ antigen trong crude protein khi làm direct ELISA, đến khi ra kết quả thẳng băng.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Western blot chỉ là qualitative, sách bảo thế mà làm thí nghiệm cũng thấy thế.
Nhiều khi rất nhiều protein băng vẫn mờ mịt.
ELISA là đúng cửa, nhưng hình như một số người quên cái chuyện nồng độ antigen trong crude protein khi làm direct ELISA, đến khi ra kết quả thẳng băng.

Em thấy nhiều báo họ dùng phần mềm phân tích ảnh western để cho ra nồng độ tại giếng này gấp giếng kia bao nhiêu lần mà.

 

[Biologist]

Ban Hung noi dung. Neu antibody cua Luong specific enough, Luong co the dung Western de quantify protein.


David

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Cái đó gọi là semiquantitative, chỉ dùng đại loại trong trường hợp: +/-. Đương nhiên ít protein thì băng mờ mà nhiều thì băng đậm. Nhưng đậm bao nhiêu lần so với băng chuẩn chưa chắc phản ánh đúng tỉ lệ hàm lượng thực sự (ngoài khoảng tuyến tính). Ngoài ra Western blot thì không đưa ra được con số cụ thể là bao nhiêu.
Thế nên khi làm Elisa tiện hơn là mình có thể tìm cái khoảng mà tại đó màu và hàm lượng protein nó quan hệ tuyến tính để tính chính xác lượng antigen (một loạt các standard và samples diluted two fold). Trường hợp này còn tiện khi sự khác nhau vừa phải, không đủ lớn lắm.

 

[Biologist]

Chac chan la Luong co the dung Elisa assay cho muc dich thi nghiem cua minh (neu Luong can biet protein concentration tuong doi chinh xac). Tuy vay, theo toi duoc biet thi khi cac ky thuat vien cung van co' the dung Western blot cho muc dich nay. Ho cung co the dung standard antigen de^? prepare a series of dilutions (which can be loaded on the same acrylamide gel for comparative analysis, subsequently).

Chuc may man,


David

 

[Lê Đức Dũng]

Cái đó gọi là semiquantitative, chỉ dùng đại loại trong trường hợp: +/-. Đương nhiên ít protein thì băng mờ mà nhiều thì băng đậm. Nhưng đậm bao nhiêu lần so với băng chuẩn chưa chắc phản ánh đúng tỉ lệ hàm lượng thực sự (ngoài khoảng tuyến tính). Ngoài ra Western blot thì không đưa ra được con số cụ thể là bao nhiêu.
Thế nên khi làm Elisa tiện hơn là mình có thể tìm cái khoảng mà tại đó màu và hàm lượng protein nó quan hệ tuyến tính để tính chính xác lượng antigen (một loạt các standard và samples diluted two fold). Trường hợp này còn tiện khi sự khác nhau vừa phải, không đủ lớn lắm.

tiện thể về protein em cũng có một vấn đề mong mọi người cho ý kiến góp ý:
số là em đang kiểm tra dòng tế bào Knock Down Gnai2, em đã kiểm tra qua RNA, Chemotaxis thì là ok, mặc dù qua RNA thì sự khác biệt tuy không lớn lắm so với mock nhưng chấp nhận được.
giờ em muốn kiểm qua thêm lượng Protein Gnai2 trên màng của KD cells và so với Mock xem có ít hơn nhiều không, em đang tính làm Western Blot, nhưng đọc thấy topic này của bác Lương cũng đang suy nghĩ không biết em có nên làm Elisa không ??! em nghĩ dù KD nhưng lượng Protein cũng không chênh lệch quá nhiều so với mock chắc cỡ 40-50%??!

à có ai biết tên hay có chương trình gì đẻ có thể phân tích ảnh Gel (DNA) trên PC mà có thể so sánh lượng DNA trên các band (kiểu như dựa vào độ sáng tối của band để biết cái này đậm hơn cía kia bao nhiêu %) cám ơn nhiều.

 

[Biologist]

PhosphorImager.

Co rat nhieu products va manufactures. Ban co the google "DNA quantification by using a PhosphorImager" de biet them chi tiet.

Chuc may man,

 

[Lê Đức Dũng]

PhosphorImager.

Co rat nhieu products va manufactures. Ban co the google "DNA quantification by using a PhosphorImager" de biet them chi tiet.

Chuc may man,

ý em là ảnh đã scan lên computer rồi ấy, em dùng phần mềm và đầu scan cảu raytest và ảnh được luu dang .tif trong PC, em muon phân tích ảnh. chắc phải dùng photoshop ??!!

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Các máy geldoc đều đi kèm phần mềm này.
Cái ELISA của bạn Dũng là direct cellular ELISA, một cách làm rẻ tiền hơn flow cytometry và thường dùng cho các clone thay vì hỗn hợp các tế bào như ở FACS. Bạn có thể tham khảo protocol ở cuốn Current protocol in molecular biology 11.2.12

 

[Lê Đức Dũng]

Các máy geldoc đều đi kèm phần mềm này.
Cái ELISA của bạn Dũng là direct cellular ELISA, một cách làm rẻ tiền hơn flow cytometry và thường dùng cho các clone thay vì hỗn hợp các tế bào như ở FACS. Bạn có thể tham khảo protocol ở cuốn Current protocol in molecular biology 11.2.12

ý kiến của bác Lương cũng hay, làm direct cellular chắc rẻ hơn. cảm ơn bác.
em đang dịnh là chiết membran protein, rồi dùng antibody dặc hiệu của gnai2 để làm elisa

 

[Pretender]

Em thấy nhiều báo họ dùng phần mềm phân tích ảnh western để cho ra nồng độ tại giếng này gấp giếng kia bao nhiêu lần mà.

Chương trình ImageJ fải không ạ? Nó sẽ invert band thành band sáng trên nền đen rồi đo mức độ sáng của band để so sánh với nhau. Cái này em dùng thường xuyên nhưng mà thô lắm, chỉ so sánh tương đối thôi, chứ định lượng thì chắc là không chuẩn đâu. Nhất là nếu gặp phải membrane không sạch, lem nhem thì thôi là thôi rồi, chán lắm!