Xin cho hỏi về "digestion"

[gauden_nt]

Em có một vấn đề như thế này xin tham khảo ý kiến: Sau khi em dùng single digestion colony PCR thì có được band mong đợi. Tuy nhiên khi em dùng double digesion thì lại không có đoạn gen đó. (plasmid dường như không bị cắt).Anh chị và các bạn nào có kinh nghiệm xin chia sẻ!

 

[Dương Văn Cường]

Bạn nghĩ mọi người là thần hay là tiên mà có thể trả lời câu hỏi kiểu này? Ít ra phải đưa các thông tin single thì dùng enzyme nào? Double thì những enzyme nào? Khi tiến hành double thì chọn buffer nào? Cho rằng plasmid "dường như không bị cắt" thì dựa vào data nào...

Em đã lặp lại nhiều thí nghiệm tương tự nhưng kết quả vẫn thế.

Nhiều lần là bao nhiêu lần? Nếu con số là 4 trở lên thì người hướng dẫn của bạn nên mời bạn ra khỏi phòng thí nghiệm cho khỏi tốn hóa chất.

Còn cái lỗi đặt tiêu đề đáng bị ban nick nữa.

 

[gauden_nt]

Không biết bạn Cường là ai nhưng kiểu ăn nói thô lỗ, cục cằn như bạn Cường đây thì kể cũng thấy buồn!bạn cứ việc ban nick nếu cảm thấy thích!

 

[Biologist]

Hi Em gauden_nt:
Khi plasmid con nguyen ven (nghia la khong bi cat) thi Em se thay tren agarose gel cac "topological forms" khac nhau cua plasmid DNA: multimeric form, supercoiled form, nicked form, linearized form, etc...

Nhu ban Cuong da giai thich: Co le la khi Em lam double-digestion, Em da dung buffer khong "compatible" voi ca hai enzymes cho nen khong digest duoc plasmid (although single digestions work for you).

One possible solution: cut with the 1st enzyme ==> ethanol precipitation ==> resuspend DNA pellet in H2O, followed by digestion with 2nd enzyme.


Chuc Em may man

 

[nguyhoanghan]

Cho mình có ý kiến!

1. Câu hỏi của gauden_nt còn hơi mơ hồ, hầu như mọi người không hiểu rõ bạn làm gì. Bạn nói bạn làm PCR colony? single digestion và double digestion mà bạn đã làm như thế nào? có thể bạn nêu rõ thì mọi người cũng như mình co thể hiểu và có thể sẽ giúp được cho bạn.

2. Nếu đúng gauden_nt làm PCR colony thì câu trả lời của David Dang khác với nội dung mà bạn cần được biết.

3. Nếu đúng là bạn làm PCR colony thì bạn chỉ cần pick up single colony rồ bạn làm phản ưng PCR như bình thường đặc biệt ở đây là trong Primers bạn phải có 2 restriction enzymes mà bạn cần cut đoạn bạn khuyếch đại. nếu colony mà bạn chọn mang plasmid chứa gene bạn mong muốn thì bạn sẽ có band như mong muốn.

4. Không hiểu double digestion của bạn là gì? nói rõ hơn nhé bạn!

 

[gauden_nt]

Cho mình có ý kiến!

1. Câu hỏi của gauden_nt còn hơi mơ hồ, hầu như mọi người không hiểu rõ bạn làm gì. Bạn nói bạn làm PCR colony? single digestion và double digestion mà bạn đã làm như thế nào? có thể bạn nêu rõ thì mọi người cũng như mình co thể hiểu và có thể sẽ giúp được cho bạn.

2. Nếu đúng gauden_nt làm PCR colony thì câu trả lời của David Dang khác với nội dung mà bạn cần được biết.

3. Nếu đúng là bạn làm PCR colony thì bạn chỉ cần pick up single colony rồ bạn làm phản ưng PCR như bình thường đặc biệt ở đây là trong Primers bạn phải có 2 restriction enzymes mà bạn cần cut đoạn bạn khuyếch đại. nếu colony mà bạn chọn mang plasmid chứa gene bạn mong muốn thì bạn sẽ có band như mong muốn.

4. Không hiểu double digestion của bạn là gì? nói rõ hơn nhé bạn!

Thank bạn nhé! Mình đã có kết quả rồi!

 

[Dương Văn Cường]

Có kết quả rồi thì tốt. Bạn làm thế nào để giải quyết được vấn đề thì post lên cho mọi người cùng học hỏi.

 

[gauden_nt]

Vấn đề mấu chốt ở đây có lẽ là đoạn gen của mình quá ngắn (chỉ 43bp). Khi quan sát trên gel thì rất khó để thấy được, do đó phải tăng số lượng Plasmid lên gấp 4 lần và tổng thể tích cuối cùng của mẫu tăng so với lúc ban đầu là 2.5 lần cụ thể : thể tích phản ứng lần 1: plasmid 6, E1:1, BSA:1; E2;1; Buffer :2;water: 9, phản ứng lần 2: plasmid 25; E1:1;E2:1;buffer:5;BSA:1; water 17).