Làm thế nào để xuất hiện băng mình mong muốn khi tiến hành PCR

[hamon]

Em đang tiến hành xác định một số đột biến của bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh. Tuy nhiên, trong thời gian này em đang gặp một số khó khăn về kết quả. Có lúc lên băng có lúc không. Em đã xem xét lại rất cẩn thận trong thao tác của mình nhưng kết quả vẫn không được đều tay. Em đã lặp lại rất nhiều lần mà vẫn chưa được. Các bác có thể giúp em một số lưu ý khi làm PCR để thành công hơn không? Em cảm ơn!

 

[viet23ht]

vấn đề là em dùng mồi nào? do em thiết kế hay mua sẵn ...
Thành phần PCR cũng là vấn đề, em đã có thành phần tối ưu chưa ...
đầu tiên phải là hoá chất chuẩn, thiết bị hỗ trợ chuẩn.,,
Em phải nói tên máy, thiết bị, hoá chất .. dùng trong thí nghiệm thì mọi người mới có thể hội chẩn giúp
Cũng có lúc mình đã gặp trường hợp tương tự, khi tối ưu xong thì cứ điều kiện đó mà phang, nhưng mất 1 tháng không lên, cuối cùng là do tối ưu và đặc biệt là hiệu suất mồi, taq.

 

[hamon]

Em sử dụng cặp mồi P1P2 và A1A2 làm nested PCR ( A1 A2 làm PCR lần 2). A1A2 sẽ khếch đại đoạn có kích thước 158bp ( nếu không đột biến) hay đoạn 150bp nếu có đột biến xảy ra. Các hóa chất và thiết bị đều mua của hãng Bio-Rahp, trừ Taq mua bên viện công nghệ sinh học ( taq chú Đào). Mẫu ADN được tách chiết từ tóc của các bệnh nhân bị bệnh hoặc nghi ngờ bị bệnh( chủ yếu từ trẻ em, một số mẫu là của người mẹ mang thai). Do sự chênh lệch về Tm của hai mồi P1 và P2 lớn nên em đã chọn điều kiện PCR như sau: 94o5' ( 94o30'' 50o1' 72o2')5x ( 94o30'' 56o1' 72o2')30x 72o10'. Sau đó lấy sản phẩm P1p2 pha loãng 200x rồi làm PCR với A1A2, điều kiện: 94o5' (94o30'' 61o30'' 72o1')45x 72o4'. Sau đó chạy điện di trên gel Acrylamide 12%, đệm TBE. Tuy nhiên, em đã thử lấy ADN chạy trực tiếp với A1A2 thì cho kết quả tốt, nhưng làm qua nested thì lại không lên băng. Em vẫn chưa rõ tại sao lại như thế? Làm cách nào để khắc phục tình trạng này?

 

[Hà Thị Minh Thi]

Theo mình biết thì Thầy Đào cũng đã từng tối ưu hoá PCR trong chẩn đoán đột biến gen ở bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh. Bạn có thể hỏi trực tiếp Thầy Đào hoặc tham khảo luận án của TS. Trần Kiêm Hảo. Mình đã từng thực tập tại PTN của Thầy Đào và thấy Thầy lấy đến 1 ul sản phẩm PCR lần 1 (không pha loãng gì cả) để làm khuôn cho lần 2. Bạn pha loãng đến 200 lần rồi lấy bao nhiêu, có ít quá không? Ngoài ra nên thử nghiệm với nhiều nồng độ Taq và nhiệt độ gắn mồi khác nhau. Nếu Tm của P1 và P2 chênh nhau nhiều thì hiệu suất sẽ kém đấy, cụ thể thì Tm của P1 và P2 là bao nhiêu?

 

[viet23ht]

Em đã tối ưu nồng độ ADN khuôn chưa ... Anh cũng hay dùng 1 đến 3 ul sản phẩm PCR 1 để làm PCR 2.
Sau khi PCR 1 em có kiểm tra sản phẩm trên agarose chưa, mục đích kiểm tra sản phẩm phụ...
Thử thay Taq xem, còn nhiệt độ bắt cặp mồi thì dựa trên thông số thiết kế mồi để lựa chọn, sau đó tối ưu dao động 1 - 2 độ cho mỗi bước.

 

[hamon]

P1 và P2 có Tm chênh nhau nhiều lắm, P1 là 52o, còn P2 khoảng 62o. Thêm một cái khó khăn nữa là trong quá trình làm dạo này em thường bị nhiễm vào mẫu đối chứng mà không rõ tại sao. Trước khi làm em có bật đẻn tím bốc cấy, có rửa tay bằng xà phòng và bằng cồn. Tất cả các hóa chất đều đã thử và không bị nhiễm. Chính vì thế kết quả của em lên rất phập phù. Hik

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

P1 và P2 có Tm chênh nhau nhiều lắm, P1 là 52o, còn P2 khoảng 62o. Thêm một cái khó khăn nữa là trong quá trình làm dạo này em thường bị nhiễm vào mẫu đối chứng mà không rõ tại sao. Trước khi làm em có bật đẻn tím bốc cấy, có rửa tay bằng xà phòng và bằng cồn. Tất cả các hóa chất đều đã thử và không bị nhiễm. Chính vì thế kết quả của em lên rất phập phù. Hik

Kiểm tra cần thận với pipet đi.

 

[cuncon]

ha mon a!lam de tai den mo roi,to khong biet ro ve van de ha lam va cung khong co kien thuc gi ve viec lam thuc nghiem. nhung ha lam "long" thi thay viec toi uu mat nhieu thoi gian day.khi toi uu hoa phai de y ca chu ki nhiet,nong do cac thanh phan phan ung,tuong quan giua moi trong va moi ngoai nua...ha co ket hop 2 round thanh mot lan chay khong, kien nhan nhe.con hien tuong ngoai nhiem van xay ra khi can than ve ve sinh nhung khi day pipet no co the day DNA cua cac mau ra duoi dang bot khi nua day mon a. to khong biet nen co the khong dung dau,xem lai nhe.chuc dat ket qua tot

 

[thinhlq]

Theo mình thì bạn nên kiểm tra lại nồng độ DNA của PCR1.Tớ nhất trí với ý kiến của bạn Hà Minh Thi "pha loãng đến 200 lần rồi lấy bao nhiêu, có ít quá không?" Rất có thể như vậy là ít, bạn tăng thêm nồng độ DNA khuôn đi.

 

[cfareast]

Theo mình thì bạn nên kiểm tra lại nồng độ DNA của PCR1.Tớ nhất trí với ý kiến của bạn Hà Minh Thi "pha loãng đến 200 lần rồi lấy bao nhiêu, có ít quá không?" Rất có thể như vậy là ít, bạn tăng thêm nồng độ DNA khuôn đi.

Topic này trôi lâu quá rồi. Hôm nay đọc thấy buồn cười. Thiết kế thí nghiệm sai cmnr thì làm nữa làm mãi, thay hóa chất tag ... cũng éo lên đâu mà làm. Tốn của phí thời gian. Để thời gian đó mà đọc các book, các tip , may ra có manh mối ra kqua tốt. Khuôn P1P2 dở ẹc như vậy mà cũng đâm đầu làm nested với nested. Chạy PCR lần 1 có éo band không mà làm PCR vòng 2. PCr condition như con qq vậy mà làm. Cái điểm cốt lõi quyết định phản ứng thì éo tối ưu , mà toàn tối ưu cái qq gì vậy trời?

 

[cfareast]

toàn những ông/bà đọc rồi comment chung chung, hoặc xui dại chủ thớt! Chủ thớt thiết kế thí nghiệm, setting PCR condition, thì sai tóe loe, bảo sao nó tậm tịt lúc lên lúc không lên? Sai ngay từ PCR vòng 1 rồi! Làm éo gì tạo được khuôn DNA nữa đâu mà đòi làm vòng 2! Không có kiến thức, hoặc không đọc các nguyên lí PCr cơ bản, mà làm như con vẹt thì chẳng bao giờ có kết quả, vì thiết kế sai cmnr. Tôi đọc thoáng cái là biết cần chỉnh cái gì để cho nó lên band. Nhưng vì topic lâu rồi. Chủ thớt giờ chắc TS, GS hết cả rồi (đa phần là giấy).