Race PCR

[tuan_pham_6885]

Chao moi nguoi.
Hien nay lab minh lam ve Race Pcr de xac dinh 1 gen trong cay trong moi. Theo chu trinh thi minh hieu nhu the nay(duoc nghe 1 anh Ta'u giai thich):
- Tim doan gen do o cay co quan he gan voi cay nghien cuu tren genbank.
- Dua vao trinh tu,thiet ke primer va chay PCR xem o cay cua minh co doan gen do ko?
- Su dung Race Pcr de sequence doan gen do tren cay cua minh.
Co ban minh hieu nhu the. Nhung ko hieu la khi dung race Pcr,sequence duoc ca gen do o cay cua minh.
Ban nao co kinh nghiem chi giup voi.
Cam on nhieu

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

1. Mời bạn sửa lại bài viết dùng tiếng Việt có dấu.

2. Việc dựa vào trình tự bảo tồn để thiết kế primer là đúng rồi. Khi đó bạn sẽ chọn được primer nằm trong vùng bảo tồn ở giữa gene của bạn.

3. Tiếp đó bạn có thể dùng 5' RACE-PCR và/hoặc 3' RACE-PCR để thu được full length sequence.

- Với 5' RACE-PCR bạn cần add thêm tail vào đầu 3´ (ví dụ dùng terminal deoxynucleotidyl transferase để add đuôi polyT. Sau đó dùng primer mà bạn thiết kế đặc hiệu cho vùng bảo tồn trong gene của bạn và primer oligoA để amplify phần này.

- VỚi 3' RACE-PCR bạn đã có sẵn polyA ở đầu 3´ nên chỉ việc dùng primer đặc hiệu và primer oligoT để amplify phần này.

Sau đó bạn giải trình tự 2 phần và ghép lại với nhau là xong.

4. Bạn sẽ dùng RNA tách chiết từ cây mà bạn nghiên cứu nên nếu thu được sản phẩm và trình tự thì chắc chắn sản phẩm đó từ cây mà bạn nghiên cứu.

5. Cũng có thể có khả năng bạn thu các bands không đặc hiệu do altenative splicing.

6. Bạn nên đọc thêm các tài liệu nói về sử dụng RACE PCR để amplify các gene chưa rõ trình tự, qua đó sẽ nắm được các bước làm và dần hiểu rõ hơn.

Good luck.

 

[tuan_pham_6885]

1. Mời bạn sửa lại bài viết dùng tiếng Việt có dấu.

2. Việc dựa vào trình tự bảo tồn để thiết kế primer là đúng rồi. Khi đó bạn sẽ chọn được primer nằm trong vùng bảo tồn ở giữa gene của bạn.

3. Tiếp đó bạn có thể dùng 5' RACE-PCR và/hoặc 3' RACE-PCR để thu được full length sequence.

- Với 5' RACE-PCR bạn cần add thêm tail vào đầu 3´ (ví dụ dùng terminal deoxynucleotidyl transferase để add đuôi polyT. Sau đó dùng primer mà bạn thiết kế đặc hiệu cho vùng bảo tồn trong gene của bạn và primer oligoA để amplify phần này.

- VỚi 3' RACE-PCR bạn đã có sẵn polyA ở đầu 3´ nên chỉ việc dùng primer đặc hiệu và primer oligoT để amplify phần này.

Sau đó bạn giải trình tự 2 phần và ghép lại với nhau là xong.

4. Bạn sẽ dùng RNA tách chiết từ cây mà bạn nghiên cứu nên nếu thu được sản phẩm và trình tự thì chắc chắn sản phẩm đó từ cây mà bạn nghiên cứu.

5. Cũng có thể có khả năng bạn thu các bands không đặc hiệu do altenative splicing.

6. Bạn nên đọc thêm các tài liệu nói về sử dụng RACE PCR để amplify các gene chưa rõ trình tự, qua đó sẽ nắm được các bước làm và dần hiểu rõ hơn.

Good luck.

Cảm ơn anh đã trả lời. Làm thực tiễn chắc cũng hiểu hơn. Nếu có vấn đề gì thì anh lại chỉ bảo em nhé.

 

[tuan_pham_6885]

Em đã làm được 1 gene. Bây giờ chuyển sang 1 gene khác. Khi em thiết kế RACE 3' primer, sản phẩm cho ra nhiều band. band chính là khoảng 500b, band của em là khoảng 800b. Em đã tách band 800 đi clone nhưng khi chạy kiểm tra colony thì lại chỉ cho sản phẩm 500b,ko có sản phẩm 800.
A Hưng có kinh nghiệm chỉ cho em với, cứ đem sequence colony đấy hay thiết kế lại Race 3' primer?

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Em đã làm được 1 gene. Bây giờ chuyển sang 1 gene khác. Khi em thiết kế RACE 3' primer, sản phẩm cho ra nhiều band. band chính là khoảng 500b, band của em là khoảng 800b. Em đã tách band 800 đi clone nhưng khi chạy kiểm tra colony thì lại chỉ cho sản phẩm 500b,ko có sản phẩm 800.
A Hưng có kinh nghiệm chỉ cho em với, cứ đem sequence colony đấy hay thiết kế lại Race 3' primer?

Vấn đề của bạn nằm ở bước PCR. Tốt nhất nên tối ưu điều kiện PCR để thu băng đặc hiệu 800bp. Đồng thời kiểm tra lại 3' primer xem có specific không. Việc bạn extract 800bp band khi sản phẩm PCR không đặc hiệu thì sẽ phải screen rất nhiều colonies để thu được right one.

Good luck.

 

[tuan_pham_6885]

Cảm ơn anh đã trả lời.
Em đã thử gradient và hot start rồi anh ah. Kết quả chỉ cho band 500là chính, band 800 mờ hơn. Có thể Race 3' primer của em không đặc hiệu. Anh Tàu lab em suggest tách band 500 đó đi sequence. Theo anh có nên ko?

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Anh Tàu lab em suggest tách band 500 đó đi sequence. Theo anh có nên ko?

Có thể thử.