Reuse of DNA isolation columns

Luyện Quốc Hải · Aug 5, 2008

[FONT=바탕]Hello....[/FONT]
[FONT=바탕]Từ năm 2007, sau khi đọc bài báo: Siddappa et.al., 2007. “Regeneration of commercial nucleic acid extraction columns without the risk of carryover contamination”. BioTechniques 42: 186-192.<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com

ffice

ffice" /><o

></o

>[/FONT]
[FONT=바탕]Tôi đã tìm hiểu và viết lại phương pháp này. Mình rất có hứng thú với phương pháp này vì nó giải đáp câu hỏi “làm sao tiết kiệm cột tinh sạch” của mình trong khi làm việc. Mong trao đổi cùng anh em.<o

></o

>[/FONT]

[FONT=바탕]* Quy trình tái sử dụng cột tinh sạch Plasmid (or DNA)<o></o>[/FONT]
[FONT=바탕]- Cột tinh sạch sau khi đã qua sử dụng được rửa và bảo quản trong 1M HCl cho đến khi sử dụng (thời gian tối thiểu bảo quản = rửa trong 1M HCl là 12 tiếng, thời gian tối đa bảo quản trong HCl mà không làm thay đổi kết quả là khoảng 1 năm – chưa có thí nghiệm kiểm tra chính xác).<o

></o

>[/FONT]
[FONT=바탕]- Trước khi sử dụng lại:<o></o>[/FONT]
[FONT=바탕]+ Cột tinh sạch sẽ được vớt ra khỏi dung dịch bảo quản (1M HCl)<o

></o

>[/FONT]
[FONT=바탕]+ Rửa sạch cột bằng 1 ml nước cất (đã khử trùng), lập lại ít nhất 5 lần.<o

></o

>[/FONT]
[FONT=바탕]+ Tiếp tục tạo độ cân bằng của màng lọc của cột bằng cách rửa bằng 5 ml Buffer QC (Qiagen) (hoặc dùng 5 ml buffer QBT) (cho từ từ đến khi hết 5 ml).<o

></o

>[/FONT]
[FONT=바탕](Các bạn nào biết thành phần của buffer QC hay QBT thì post lên đây cho đủ nhé)[/FONT]
[FONT=바탕][/FONT]
[FONT=바탕][FONT=바탕]Như vậy, cột tinh sạch đã được refresh. Từ cột này các bạn có thể sử dụng như cột New bình thường.<o

></o

>[FONT=바탕]
<o

></o

>[/FONT][/FONT][FONT=바탕]<o

></o

>[/FONT][/FONT][FONT=바탕]<o

></o

>[/FONT]

[FONT=바탕]Một số lưu ý:<o></o>[/FONT]
[FONT=바탕][/FONT]
[FONT=바탕][FONT=바탕]- Nếu dùng dung dịch 0.1M HCl thì thời gian bảo quản tối thiểu (để loại bỏ DNA bám vào màng) là 48h, nhưng nếu dùng 1M HCl thì sau 4h đã OK rồi, nhưng tốt nhất nên để sau 12 tiếng mới sử dụng thì đảm bảo hơn.<o

></o

>
[FONT=바탕]- Việc bảo quản cột trong 1M HCl trong thời gian 30 ngày hay lâu hơn vẫn không ảnh hưởng gì đến khả năng tinh sạch DNA của cột.<o

></o

>
[FONT=바탕]- Cột được tái sử dụng hơn 20 lần vẫn cho kết quả rất tốt.<o

></o

>

[/FONT][/FONT][FONT=바탕]<o

></o

>
[/FONT]
[/FONT][/FONT]
[FONT=바탕]<o

></o

>[/FONT]
[FONT=바탕]<o

>* </o

>[/FONT][FONT=바탕]Thành phần một số dung dịch sử dụng trong Kit tinh sạch Plasmid (Vì các thành phần này thường chỉ được trình bày trong các quyển hướng dẫn sử dụng Kit 5-8 năm về trước. Các quyển sách hướng dẫn gần đây đã được tóm tắt sơ lược):<o

></o

>[/FONT]
[FONT=바탕](Theo tài liệu: High Pure Plasmid Isolation Kit. ROCHE Cat. No. 1 754 777. 2001)<o

></o

>[/FONT]
1) [FONT=바탕]Suspension Buffer: 25ml: 50 mM Tris-HCl and 10 mM EDTA, pH= 8 (25oC)<o

></o

>[/FONT]
2) [FONT=바탕]RNase A: 2,5mg dry powder for dissolution in Suspension Buffer (25 ml).<o

></o

>[/FONT]
3) [FONT=바탕]Lysis Buffer: 25 ml : 0.2 M NaOH, 1% SDS<o

></o

>[/FONT]
4) [FONT=바탕]Binding Buffer: 25 : 4M Guanidine hydrochloride and 0.5 M Postassium acetate, pH= 4.2<o

></o

>[/FONT]
5) <?xml:namespace prefix = st1 ns = "urn:schemas-microsoft-com

ffice:smarttags" /><st1:State w:st="on"><st1

lace w:st="on">[FONT=바탕]Wash</st1

lace></st1:State>[FONT=바탕] Buffer 1: 33 ml add 20 ml ethanol (including: 5 M Guanidine Hydrochloride, 20 mM Tris HCl, pH=6.6 (25oC) final concentration after addition of Ethanol). Note: For strains with high nuclease activity.<o

></o

>[/FONT][/FONT]
6) <st1:State w:st="on"><st1

lace w:st="on">[FONT=바탕]Wash</st1

lace></st1:State>[FONT=바탕] Buffer 2: 10 ml add 40 ml Ethanol (including: 20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH=7.5 final concentration after addition Ethanol).<o

></o

>[/FONT][/FONT]
[FONT=바탕]<o

></o

>[/FONT]
[FONT=바탕]<o

></o

>[/FONT]
[FONT=바탕]Câu hỏi đặt ra:<o></o>[/FONT]
[FONT=바탕]- Tại sao lại phải dùng HCl để rửa (mà không dùng NaOH)?<o

></o

>[/FONT]
[FONT=바탕]- Bổ sung thành phần dung dịch Buffer QC và QBT.<o

></o

>[/FONT]
[FONT=바탕]- Giải thích câu: “For strains with high nuclease activity”<o

></o

>[/FONT]
[FONT=바탕]- Giải thích vai trò của từng hóa chất có trong các dung dịch tách chiết DNA (ví dụ: SDS, Guanidine hydrochloride, RNase A, Ethanol, ……)<o

></o

>[/FONT]
[FONT=바탕]- Nếu ai test thử phương pháp này thì post kết quả và biện luận cho anh em tham khảo nhé.<o

></o

>[/FONT]
[FONT=바탕]<o

></o

>[/FONT]
[FONT=바탕]Chúc vui vẻ.
[FONT=바탕]LQH<o

></o

>[/FONT][/FONT]
[FONT=바탕]http://www.sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?name=News&file=article&sid=1140<o

></o

>[/FONT]
[FONT=바탕]<o

></o

>[/FONT]
[FONT=바탕]http://www.scienceboard.net/forum/topic.asp?TOPIC_ID=3899&FORUM_ID=19&CAT_ID=10&Topic_Title=Reuse+of+DNA+isolation+columns&Forum_Title=Bio+Kits+and+Reagents<o

></o

>[/FONT]
[FONT=바탕]<o

></o

>[/FONT]
[FONT=바탕]<o

></o

>[/FONT]

Nguyễn Xuân Hưng · Aug 5, 2008

Nói chung là tái sử dụng hơi tốn công với lại kết quả trục trặc dễ dẫn đến nghi ngờ . Tuy nhiên nhà nào nghèo thì cũng nên dùng "đồ tái".

Qiagen Buffer QBT<o></o>

100 mL<o

></o

>
NaCl 4.38 g<o

></o

>
Ethanol 15 mL
MOPS 1.05 g
Triton X-100 150 ml
pH to 7.0 (use 1N)
<o> </o>

Qiagen Buffer QC

100 mL<o

></o

>
NaCl 5.84 g
MOPS 1.05 g
Ethanol 15 mL
pH to 7.0, filter sterilize.

<link rel="File-List" href="file:///C:%5CDOKUME%7E1%5CBEGGIN%7E1%5CLOKALE%7E1%5CTemp%5Cmsohtmlclip1%5C01%5Cclip_filelist.xml"><link rel="themeData" href="file:///C:%5CDOKUME%7E1%5CBEGGIN%7E1%5CLOKALE%7E1%5CTemp%5Cmsohtmlclip1%5C01%5Cclip_themedata.thmx"><link rel="colorSchemeMapping" href="file:///C:%5CDOKUME%7E1%5CBEGGIN%7E1%5CLOKALE%7E1%5CTemp%5Cmsohtmlclip1%5C01%5Cclip_colorschememapping.xml"><!--[if gte mso 9]><xml> <w:WordDocument> <w:View>Normal</w:View> <w:Zoom>0</w:Zoom> <w:TrackMoves/> <w:TrackFormatting/> <w

unctuationKerning/> <w:ValidateAgainstSchemas/> <w:SaveIfXMLInvalid>false</w:SaveIfXMLInvalid> <w:IgnoreMixedContent>false</w:IgnoreMixedContent> <w:AlwaysShowPlaceholderText>false</w:AlwaysShowPlaceholderText> <w

oNotPromoteQF/> <w:LidThemeOther>EN-US</w:LidThemeOther> <w:LidThemeAsian>X-NONE</w:LidThemeAsian> <w:LidThemeComplexScript>X-NONE</w:LidThemeComplexScript> <w:Compatibility> <w:BreakWrappedTables/> <w:SnapToGridInCell/> <w:WrapTextWithPunct/> <w:UseAsianBreakRules/> <w

ontGrowAutofit/> <w:SplitPgBreakAndParaMark/> <w

ontVertAlignCellWithSp/> <w

ontBreakConstrainedForcedTables/> <w

ontVertAlignInTxbx/> <w:Word11KerningPairs/> <w:CachedColBalance/> </w:Compatibility> <w:BrowserLevel>MicrosoftInternetExplorer4</w:BrowserLevel> <m:mathPr> <m:mathFont m:val="Cambria Math"/> <m:brkBin m:val="before"/> <m:brkBinSub m:val="--"/> <m:smallFrac m:val="off"/> <m:dispDef/> <m:lMargin m:val="0"/> <m:rMargin m:val="0"/> <m:defJc m:val="centerGroup"/> <m:wrapIndent m:val="1440"/> <m:intLim m:val="subSup"/> <m:naryLim m:val="undOvr"/> </m:mathPr></w:WordDocument> </xml><![endif]--><style>  </style> Qiagen Buffer QF

100 mL<o

></o

>
NaCl 7.31 g
MOPS 1.03 g
Ethanol 15 mL
PH to 8.2

Đinh Duy Thành · Aug 5, 2008

Các bác đoán xem đâu là cột mới? :mrgreen:

Nguyễn Xuân Hưng · Aug 5, 2008

Đinh Duy Thành said:
Các bác đoán xem đâu là cột mới?

Hỏi thế thì biết đáp án rồi.

Quan trọng là Thành test xem khả năng cross-contaminated. Chứ efficiency thì không quan trọng mấy.

Luyện Quốc Hải · Aug 5, 2008

Nguyễn Xuân Hưng said:
Hỏi thế thì biết đáp án rồi.

Quan trọng là Thành test xem khả năng cross-contaminated. Chứ efficiency thì không quan trọng mấy.

Mình có bài báo này: Siddappa et.al., 2007. “Regeneration of commercial nucleic acid extraction columns without the risk of carryover contamination”. BioTechniques 42: 186-192.
Nhưng không có file (file vứt đâu mất rồi). Ai có thể lấy lại thì up lên đây.
Trong bài báo này, các tác giả đã kiểm tra hết các khả năng bị tạp nhiễm DNA, kết quả rất TỐT.
Các bạn có thể kiểm tra bằng cách: Cột New, tách DNA plasmid tái tổ hợp, rồi làm các bước tái sử dụng. Sau đó, lại dùng nó để tách DNA plasmid tái tổ hợp khác. Kiểm tra nhiễm DNA lần trước đó, bằng cách chạy PCR bằng primer của Plasmid tái tổ hợp của lần trước, và của cả lần tinh sạch sau .....
Nói chung, có nhiều cách kiểm tra. Ai có điều kiện test thì báo cho anh em biết.

Quan điểm cá nhân: Tiết kiệm là tốt. Nên dùng cách này để tách các loại Plasmid chỉ dùng để kiểm tra kết quả thí nghiệm, còn nếu đã tách chiết plasmid dùng cho các lần thí nghiệm tiếp theo (ý là rất quan trọng) thì nên dùng cột mới (không thì cty hóa chất phá sản à). Hoặc là "ai gan to" thì có thể mỗi lần làm là loại Plasmid mang gen hoàn toàn khác nhau (cái này người làm thí nghiệm phải nắm được).
Bây giờ, các bạn VN ở nước ngoài, cứ thấy bọn nó tách plasmid xong là tích trữ lại nhé.......
Thêm một nguồn cột tinh sạch Free nữa là: bọn nó thường thấy HẾT HẠN là không giám dùng.........hic... :mrgreen:

. Lụm về ngay, xài tốt. Hóa chất thì ở phía trên đã list rồi đây.
Nghèo nhưng vẫn làm được thí nghiệm mới là tài.....

Nguyễn Xuân Hưng · Aug 6, 2008

Luyện Quốc Hải said:
Mình có bài báo này: Siddappa et.al., 2007. “Regeneration of commercial nucleic acid extraction columns without the risk of carryover contamination”. BioTechniques 42: 186-192.
Nhưng không có file (file vứt đâu mất rồi). Ai có thể lấy lại thì up lên đây.
Trong bài báo này, các tác giả đã kiểm tra hết các khả năng bị tạp nhiễm DNA, kết quả rất TỐT.
Các bạn có thể kiểm tra bằng cách: Cột New, tách DNA plasmid tái tổ hợp, rồi làm các bước tái sử dụng. Sau đó, lại dùng nó để tách DNA plasmid tái tổ hợp khác. Kiểm tra nhiễm DNA lần trước đó, bằng cách chạy PCR bằng primer của Plasmid tái tổ hợp của lần trước, và của cả lần tinh sạch sau .....
Nói chung, có nhiều cách kiểm tra. Ai có điều kiện test thì báo cho anh em biết.

Quan điểm cá nhân: Tiết kiệm là tốt. Nên dùng cách này để tách các loại Plasmid chỉ dùng để kiểm tra kết quả thí nghiệm, còn nếu đã tách chiết plasmid dùng cho các lần thí nghiệm tiếp theo (ý là rất quan trọng) thì nên dùng cột mới (không thì cty hóa chất phá sản à). Hoặc là "ai gan to" thì có thể mỗi lần làm là loại Plasmid mang gen hoàn toàn khác nhau (cái này người làm thí nghiệm phải nắm được).
Bây giờ, các bạn VN ở nước ngoài, cứ thấy bọn nó tách plasmid xong là tích trữ lại nhé.......
Thêm một nguồn cột tinh sạch Free nữa là: bọn nó thường thấy HẾT HẠN là không giám dùng.........hic.... Lụm về ngay, xài tốt. Hóa chất thì ở phía trên đã list rồi đây.
Nghèo nhưng vẫn làm được thí nghiệm mới là tài.....

Báo viết là một chuyện thôi. Quan trọng vẫn là kiểm tra xem với mình thì thí nghiệm có work không. Cho dù anh em ở đây test chán chê rồi thì nếu tôi dùng cũng sẽ kiểm tra lại :mrgreen:

.

Một điểm quan trọng nữa là mong bạn nào có thể tính chi phí. Xem tái sử dụng lại cột thì mất bao tiền. Sau đó hóa chất dùng cho cột tái sử dụng đó bao tiền. Cộng 2 cái vào, cộng thêm thời gian mất cho việc tái sử dụng rồi so với giá thành kit mới xem tiết kiệm được bao nhiêu tiền. Hiện tại nhiều hãng của Hàn Quốc chẳng hạn bán kit rẻ lắm. Qiagen thuộc loại đắt nhất rồi.

Reuse of DNA isolation columns

Luyện Quốc Hải

Senior Member

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator

Đinh Duy Thành

Senior Member

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator

Luyện Quốc Hải

Senior Member

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator

Similar threads

Facebook

Thống kê diễn đàn