DNA shuffling

[Huỳnh Chấn Khôn]

Các anh chị có kinh nghiệm về DNA shuffling xin góp ý giùm em.
Em đang làm shuffling. Sau khi tối ưu tất cà các thông số từ phản ứng cắt DNA bằng Dnase I, self-assembly without degenerated primer, roi self-assembly with degenerated primers, final PCR...Em đã tìm ra được điều kiện tối ưu cho kết quả final PCR tốt (băng DNA cũng kha khá). Nhưng khi lặp lại một lần nữa để chuẩn bị scale up thì em lại gặp rắc rối. Sản phẩm final PCR của em lúc này lại ít đi, em đã thử lại rất nhiều điều kiện rồi nhưng vẫn chưa thể thu được sản phẩm giống lúc ban đầu.
Các anh chị góp ý giùm em, đối với DNA shuffling thì yếu tố nào quan trọng nhất?

 

[Luyện Quốc Hải]

Các anh chị góp ý giùm em, đối với DNA shuffling thì yếu tố nào quan trọng nhất?

Yếu tố may mắn, vì đây là đột biến ngẫu nhiên có định hướng. Chịu khó làm đi làm lại thì có một ngày đẹp trời, kết quả lại tốt.
Có điều kiện thì post cái kết quả của đợt thí nghiệm vừa thành công đó lên đây cho mọi người tham khảo nhé. Hồi SV mình có làm nhưng chỉ "cưỡi ngựa xem hoa"....
Goodluck

 

[Cao Xuân Hiếu]

Yếu tố may mắn, vì đây là đột biến ngẫu nhiên có định hướng. Chịu khó làm đi làm lại thì có một ngày đẹp trời, kết quả lại tốt.
Có điều kiện thì post cái kết quả của đợt thí nghiệm vừa thành công đó lên đây cho mọi người tham khảo nhé. Hồi SV mình có làm nhưng chỉ "cưỡi ngựa xem hoa"....
Goodluck

Đối với những thí nghiệm kiểu này thì cần phải thiết kế thí nghiệm tốt và có các biện pháp sàng lọc sản phẩm hữu hiệu. Theo tôi hiểu thì ko cần thiết lắm đến yêu cầu phải lặp lại thí nghiệm.

 

[Luyện Quốc Hải]

Em đã tìm ra được điều kiện tối ưu cho kết quả final PCR tốt (băng DNA cũng kha khá).

Mình không hiểu là, khi bạn đã có final PCR, mà thực tế đây là một hỗn hợp (một thư viện) các đoạn ADN mang các đột biến của cùng một gen và có cùng degenerated primers. Từ hỗn hợp này có thể sử dụng như template cho PCR để nhân số lượng lớn, sau đó làm một ngân hàng clone, rồi chọn lọc hoạt tính theo định hướng. Khi đã chọn được 1 hay vài clone cho hoạt tính cao hơn gen ban đầu thì lại sử dụng các gen này cho lần thí nghiệm tiếp theo, để cuối cùng tạo ra nhưng gen đột biến có hoạt tính cao hơn gấp nhiều lần. (ví dụ: Hoạt tính amylase tăng > 100 lần) (cũng có thể kết hợp với Error Prone PCR để tăng hiệu quả).
Nếu như Khôi đã nói là "Em đã tìm ra được điều kiện tối ưu cho kết quả final PCR tốt (băng DNA cũng kha khá)" thì sao Khôi không lấy tạm cái sản phẩm này để sàng lọc hoạt tính đã. Mỗi lần làm sẽ cho kết quả khác nhau vì trong quá trình PCR lần 1 (PCR tự mồi) diễn ra rất ngẫu nhiên (và quá trình cắt DNAse I cũng đã ngẫu nhiên rồi).
Goodluck

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Các anh chị có kinh nghiệm về DNA shuffling xin góp ý giùm em.
Em đang làm shuffling. Sau khi tối ưu tất cà các thông số từ phản ứng cắt DNA bằng Dnase I, self-assembly without degenerated primer, roi self-assembly with degenerated primers, final PCR...Em đã tìm ra được điều kiện tối ưu cho kết quả final PCR tốt (băng DNA cũng kha khá). Nhưng khi lặp lại một lần nữa để chuẩn bị scale up thì em lại gặp rắc rối. Sản phẩm final PCR của em lúc này lại ít đi, em đã thử lại rất nhiều điều kiện rồi nhưng vẫn chưa thể thu được sản phẩm giống lúc ban đầu.
Các anh chị góp ý giùm em, đối với DNA shuffling thì yếu tố nào quan trọng nhất?

Mục tiêu của thí nghiệm là gì thế? Vì sao không làm error-prone PCR có phải dễ hơn không?

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Em cảm ơn anh chị đã quan tâm, chia sẽ những kiến thức cũng như thảo luận cùng em.
Chào anh Hải,
Yếu tố may mắn anh nói ở đây theo em hiểu là sự tạo đột biến nhờ các degenerate primers trong quá trình self-assembly. Nếu như may mắn thì đột biến sẽ được tạo ở những vị trí thích hợp trong đoạn gen để từ đó tăng haọt tính của protein lên. Nhưng vấn đề em đề cập ở đây là điều kiện PCR. Em ko hiểu vì lý do gì mà lúc thì em thành công lúc thì thất bại (đúng hơn là thất bại nhiều hơn) mặc dù làm ở cùng điều kiện như nhau.
Em đã có sản phẩm PCR thành công. Nhưng để dựng được một cái library thì em cần rất nhiều DNA (khoảng 200ug) (em dùng tế bào nấm men S.cerevisiae làm host để tạo ra một thư viện tế bào với mỗi tế bào sẽ chứa một gen đột biến khác nhau). Do cần một lượng lớn DNA nên em phải scale up số lượng PCR lên để thu được nhiều DNA. Nhưng trước khi scale up, em check lai một lần nữa bằng cách chạy thử một vài phản ứng thì lại thất bại. Do vậy mà em mới hỏi về yếu tố nào quyết định sự thành công trong DNA shuffling.

Anh Hưng,
Mục tiêu của thí nghiệm là tạo được một library bao gồm các đột biến (variants) từ protein ban đầu. Sau đó sẽ sàng lọc để tìm ra những protein đột biến nào có ái lực cao, hoạt tính cao...
Error prone PCR là phương pháp thông thường, được sử dụng rất nhiều. Nhưng error prone PCR là phương pháp tạo đột biến ngẫu nhiên trên toàn bộ trình tự gen. Còn phương pháp em đang sử dụng cũng tạo đột biến ngẫu nhiên, nhưng có chủ đích ( sẽ gây đột biến ỡ những vùng nhất định trên trình tự đoạn gen...) Và bằng cách kết hợp DNA shuffling với degenerate primers (hay nói đúng hơn là spkied primers) em hi vọng chất lượng của library sẽ tốt hơn khi dựng bằng ErPCR.

Anh Hiếu,
Em đồng ý với anh là phải thiết kế điều kiện thí nghiệm tốt và lựa chọn phương pháp sàng lọc tốt. Đó là cái em đang làm đây (hay đúng hơn là đang gặp khó khăn)

 

[Cao Xuân Hiếu]

OKie, giờ anh đã hiểu vấn đề của em.

1, em kiểm tra lại các thông số /vấn đề của final PCR. Em có sử dụng đối chứng dương k? Em có tinh sạch template trước final PCR k?
2, em kiểm tra chất lượng sản phẩm sau mỗi 1 bước phản ứng enzyme ntn?
3, em sử dụng strategy nào để scale up sản phẩm? kết quả gần đây nhất thì ko có product trong final PCR hay là ít hơn nhiều lần? ko được tỉ lệ với hệ số tăng hay không bằng được với lượng sản phẩm thử nghiệm ban đầu?.
4, cho anh chi tiết protocol của DNA shuffling mà em đã tối ưu được k?

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Chào anh Hiếu, xin được trả lời từng câu hỏi của anh
1. em kiểm tra lại các thông số /vấn đề của final PCR. Em có sử dụng đối chứng dương k? Em có tinh sạch template trước final PCR k?
--> Khi kiểm tra lại các thông số của fianl PCR, em dùng 2 đối chứng: 1 là self-assembly chỉ có các fragment (không có soiked primers), 2 là mẫu self-assembly thành công ban đầu, kết quả thì 2 mẫu đối chứng kết quả ra tốt, còn các mẫu còn lại thì không ra band hoặc band rất mờ.
Em chỉ tinh sạch sau khi cắt bằng DNaseI, còn sau phản ứng self-assembly thì em ko tinh sạch mà chỉ lấy mẫu trực tiếp từ phản ứng, pha loãng và chạy final PCR.

2, em kiểm tra chất lượng sản phẩm sau mỗi 1 bước phản ứng enzyme ntn?
--> Sau khi cắt DNaseI, em chạy trên gel (2% agarose), sau đó xem kết quả, thường thì phần lớn fragments sẽ nằm ở vị trí từ 50-100 bps--> cắt gel và tinh sạch.
--> Sau phản ứng self-assembly thì em kiểm tra trên gel 0.7% agarose, thông thường thì sẽ có một dãy sáng từ trên xuống ( thực tế em làm thì dãy sáng chĩ chạy từ vị trí hơi cao hơn band mong muốn cho tới vị trí khoảng 50 bps-là vị trí của các fragment, primers còn dư. Khoảng cách của vệt sáng và mức độ sáng tùy thuộc vào tỉ lệ Frag/Primer mà em sử dụng)

3, em sử dụng strategy nào để scale up sản phẩm? kết quả gần đây nhất thì ko có product trong final PCR hay là ít hơn nhiều lần? ko được tỉ lệ với hệ số tăng hay không bằng được với lượng sản phẩm thử nghiệm ban đầu?.
--> Em chỉ tăng thể tích trong phản ứng cắt và số lượng phản ứng PCR thôi, còn điều kiện vẫn giữ nguyên.
--> Kết quả gần đây nhất thì lúc ra lúc không (lúc thì ra band mong muốn, lúc thì chỉ ra một vệt sáng dài). Tất cả những lần thành công gần đây kết quả đều ra band rất mờ, có thể chỉ bằng 1.4 hay 1/5 so với lúc thành công ban đầu (trong final PCR mặc dù khi so sánh về self-assembly thì gần như giống nhau).

4, cho anh chi tiết protocol của DNA shuffling mà em đã tối ưu được k?
DNase I digestion
2 ug DNA
0.15 U Dnase I
Incubated at 37 0C in 7 min.
Heat inactivation at 65 0C/10 min in the presence of stop buffer
Frag of 50-100 bps were purified by gel extraction kit --> concentration was measured by using spec. 260 nm

SEM condition
Fragment conc.: 10 ng/ul (total 500 ng)
Frag/Oligo ratio: 1/40 (molar ratio)
PCR condition:
94 0C: 2 min
50 0C: 45s 1 cycle
72 0C: 1min30s

94 0C: 30s
50 0C: 45s 50 cycles (bây giờ thì em giảm xuống 45 cycles theo lời GS)
72 0C: 1min30s

72 0C: 5 min

Final PCR
Dilution factor: 1/20
Annealing temp.: 65 0C
The PCR program was 94 0C for 2 min, following with 30 cycles composed of : 94 0C (30s), 65 0C (30s) and 72 0C (60s) and a final 5 min elongation step at 72 0C.

Đó là điều kiện mà em đã tối ưu. Spiked primers của em gồm 12 primers (6 forward và 6 reverse, mỗi primer dài khoảng 50 bps).

 

[Luyện Quốc Hải]

Các anh chị có kinh nghiệm về DNA shuffling xin góp ý giùm em.
. Sau khi tối ưu tất cả các thông số từ phản ứng cắt DNA bằng Dnase I, self-assembly without degenerated primer, roi self-assembly with degenerated primers, final PCR...Em đã tìm ra được điều kiện tối ưu cho kết quả final PCR tốt (băng DNA cũng kha khá).

Xin phép được phân tích cách viết câu hỏi của Khôn một chút.
Mình không nhớ trong 1 chương trình của VTV3 có đặt câu hỏi như sau: Hãy tìm ra lỗi sai ở câu sau "Trong quá trình làm DNA shuffling, Tôi đã tìm được điều kiện tối ưu nhất.......". Trả lời: câu này sai ở: đã là tối ưu thì là NHẤT rồi, nên không được thêm từ nhất ở đằng sau nữa.

Ok, trở lại vấn đề của Khôn, Em đã nói là tối ưu được tất cả các bước, anh tôn trọng kết quả nghiên cứu của tác giả nên không có ý kiến gì về quá trình làm thí nghiệm (mà cũng chẳng biết Khôn đã làm những gì để tối ưu mà góp ý).
Còn trong quá trình thực nghiệm, việc thiết kế thí nghiệm và phương pháp sàng lọc một cách tối ưu là yêu cầu ĐẦU TIÊN, không cần phải bàn cãi gì.
Vấn đề là làm sao để TỐI ƯU được mới là vấn đề cần bàn.

Với những gì mà Khôn đã trả lời dựa theo câu hỏi của Hiếu giúp cho mọi việc góp ý trở nên dễ dàng hơn. Đây cũng là một bài học cho những ai muốn đặt câu hỏi (Người khác có thể trả lời đúng mong muốn của mình khi người ta có thể hiểu rõ câu hỏi, hiểu rõ thí nghiệm đang tiến hành).

Dựa theo những thí nghiệm của Khôn, mình chỉ có một số góp ý sau:
Quá trình tối ưu điều kiện thí nghiệm thì GS của Khôn là "sư phụ" rồi, mà thực tế các bước tiến hành của Khôn đều có kết quả tối ưu.
- Bước cắt bằng DNAse I: cho kết quả các dãy băng có kích thước 50-100bp có thể nói là TỐI ƯU rồi (Khôn làm rất tốt).
- Cho đến bước Self-Assembly, Khôn cho ra các băng "thực tế em làm thì dãy sáng chĩ chạy từ vị trí hơi cao hơn band mong muốn cho tới vị trí khoảng 50 bps-là vị trí của các fragment, primers còn dư." Đây cũng là kết quả rất tốt, mình cũng chẳng có góp ý gì được hơn nữa.
- Vấn đề chính là ở bước cuối cùng final PCR:
Khôn đã scale up bằng cách tăng số lượng phản ứng PCR, trong đó giữ nguyên các điều kiện..... Ở đây, cần phải nhấn mạnh là Khôn chỉ nên tăng Số Lượng phản ứng PCR mà không nên tăng thể tích mỗi phản ứng PCR, vì như vậy kết quả cũng sẽ khác. (khôn làm như thế nào???)
Còn nếu Khôn đã giữ nguyên các điều kiện như lần đầu tiên mà kết quả phập phù (lúc ra băng mờ, lúc ra smear), thì theo mình nghĩ:
1. Mỗi lần làm là có một thư viện, mặc dù hàm lượng DNA không cao, do đó làm nhiều lần và gộp lại thì cũng được.
2. Nếu final PCR ra băng mờ thì cắt băng đó ra, làm template cho final PCR 2. Lúc đó các băng mờ đó sẽ được khuyếch đại.....
Cuối cùng, mời các "Sư phụ" thực thụ của DNA-shuffling giúp đỡ thêm.

Chào

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Em rất vui khi nhận được những ý kiến từ anh Hải.
Trước tiên, em xin đính chính lại một chút. Em tên là Khôn ạ. Nhiều người cứ lầm lẫn em tên Khôi, mặc dù cũng thích tên Khôi, nhưng dù sao tên Khôn vẫn thích hơn. Em chỉ đùa chút thôi, anh Hải đừng giận nha.
Bây giờ xin được đi vào những câu hỏi của anh Hải.
Anh đã không bàn luận đến vần đề làm sao em tối ưu điều kiện thí nghiệm và chấp nhận những thông số nên em sẽ không đem ra bàn bạc ở đây.

1. Mỗi lần làm là có một thư viện, mặc dù hàm lượng DNA không cao, do đó làm nhiều lần và gộp lại thì cũng được.
-->Em đồng ý. Nhưng vấn đề là hàm lượng quá thấp, em còn phải làm gel elution nữa nên càng mất thêm DNA. Em nhớ có lần tính toán thử, thì con số pcr phải chạy lên đến 700 phản ứng (khiếp). Bình thường thì chỉ khoảng 200-250 phản ứng thôi để thu được 200 ug DNA.

2. Nếu final PCR ra băng mờ thì cắt băng đó ra, làm template cho final PCR 2. Lúc đó các băng mờ đó sẽ được khuyếch đại.....
-->Em cũng đang tính tới bước đó (nếu như lâm vào đường cùng hic hic...) Chỉ sợ là như vậy thì tính đa dạng (diveristy) của library ko tốt lắm.

3.Khôi đã scale up bằng cách tăng số lượng phản ứng PCR, trong đó giữ nguyên các điều kiện..... Ở đây, cần phải nhấn mạnh là Khôi chỉ nên tăng Số Lượng phản ứng PCR mà không nên tăng thể tích mỗi phản ứng PCR, vì như vậy kết quả cũng sẽ khác. (khôi làm như thế nào???)
--> À, vấn đề của em là vậy. Em chỉ scale up về số lượng phàn ứng thôi, còn thể tích vẫn giữ nguyên. Em không những scale up số lượng final PCR mà em scale up cả số lượng phản ứng self-assembly. Mà cứ mỗi phản ứng self-assembly khác nhau là lại cho final PCR khác nhau (lúc ra band lúc ko hoặc rất mờ) mặc dù các điều kiện như nhau. Đó chính là vấn đề trở ngại của em.

Nói chung em xin được cảm ơn các anh chị đã tham gia giúp đỡ em. Các anh chị còn ý kiến nào thì xin góp ý với em tiếp. Em xin chân thành cảm ơn. Em thấy hình như trong quá trình làm thì nghiệm, em là đứa luôn gặp phải những trắc trở -^-^-. Nhưng dù sao qua những lần đó, em có được rất nhiều kinh nghiệm (mặc dù bị GS la hoài).

 

[Cao Xuân Hiếu]

Chào anh Hiếu, xin được trả lời từng câu hỏi của anh
4, cho anh chi tiết protocol của DNA shuffling mà em đã tối ưu được k?
DNase I digestion
2 ug DNA
0.15 U Dnase I
Incubated at 37 0C in 7 min.
Heat inactivation at 65 0C/10 min in the presence of stop buffer
Frag of 50-100 bps were purified by gel extraction kit --> concentration was measured by using spec. 260 nm

SEM condition
Fragment conc.: 10 ng/ul (total 500 ng)
Frag/Oligo ratio: 1/40 (molar ratio)
PCR condition:
94 0C: 2 min
50 0C: 45s 1 cycle
72 0C: 1min30s

94 0C: 30s
50 0C: 45s 50 cycles (bây giờ thì em giảm xuống 45 cycles theo lời GS)
72 0C: 1min30s

72 0C: 5 min

Final PCR
Dilution factor: 1/20
Annealing temp.: 65 0C
The PCR program was 94 0C for 2 min, following with 30 cycles composed of : 94 0C (30s), 65 0C (30s) and 72 0C (60s) and a final 5 min elongation step at 72 0C.

Đó là điều kiện mà em đã tối ưu. Spiked primers của em gồm 12 primers (6 forward và 6 reverse, mỗi primer dài khoảng 50 bps).

Có 2 chỗ có thể can thiệp là final PCR và self-assembly . => nếu giải quyết được tại final PCR là tốt nhất

1, Em đã từng tối ưu hóa final PCR ở những điều kiện ntn? đã lặp lại việc tối ưu hóa với những sản phẩm self-assembly mới gần đây chưa? hay chỉ giữ nguyên việc tối ưu của phản ứng đẹp nhất

2, Em có đánh giá nồng độ sản phẩm self-assembly để làm nguyên liệu cho final PCR hay k? Đã thử các nồng độ sản phẩm self-assembly khác nhau chưa?

3, cái anneal tem 65°C có cao quá ko? thử giảm đc k? nếu không, bình thường với một nhiệt độ như vậy anh ko chạy PCR 3 bước mà chuyển thành PCR 2 bước thì thường sản phẩm nhiều hơn. Em thử với

Final PCR
Dilution factor: 1/20 & 1/50
Annealing temp.: 68 °C
The PCR program was 94 0C for 2 min, following with 30 cycles composed of : 94 °C (30s), 68 °C (90s) and a final 5 min elongation step at 72 0C.

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

1, Em đã từng tối ưu hóa final PCR ở những điều kiện ntn? đã lặp lại việc tối ưu hóa với những sản phẩm self-assembly mới gần đây chưa? hay chỉ giữ nguyên việc tối ưu của phản ứng đẹp nhất

--> Em đã từng tối ưu bằng cách thay đổi tỉ lệ pha loãng từ phản ứng self-assembly (1/20-1/100), thử các anneal tem từ 50-65 0C. Và từ đó rút ra được điều kiện tối ưu là 1/20 và 65 0C (thật ra thì em thấy giữa những điều kiện này kết quả ko khác nhau lắm, nhưng em chọn anneal tem 65 để tránh việc bắt cặp không đặc hiệu giữa các fagment còn dư với template - đây là suy nghĩ của em, nhưng dường như kết quả ko đúng với suy nghĩ).
Những sản phẩm self-assembly gần đây em cũng thử lại tỉ lệ pha loãng để đưa sang final PCR

2, Em có đánh giá nồng độ sản phẩm self-assembly để làm nguyên liệu cho final PCR hay k? Đã thử các nồng độ sản phẩm self-assembly khác nhau chưa?
Dạ, có.

3, cái anneal tem 65°C có cao quá ko? thử giảm đc k? nếu không, bình thường với một nhiệt độ như vậy anh ko chạy PCR 3 bước mà chuyển thành PCR 2 bước thì thường sản phẩm nhiều hơn. Em thử với
Em nghĩ giảm xuống cũng ko sao, vì thực tế từ 55-65 kết quả ko khác nhau lắm nên em sẽ giảm xuống 55.

Em sẽ thử những gì anh em mình bàn luận hôm nay. Cảm ơn anh Hiếu đã gợi ý. Hi vọng em sẽ sớm khắc phục (em điên đầu với cái thí nghiệm này gần 2 tháng rồi, thử nghiệm tùm lum ).

 

[Cao Xuân Hiếu]

Ket qua cua chu Khon nhu the nao? Co gi positive k?

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Anh Hiếu,
Cảm ơn anh đã quan tâm. Em vẫn đang trục trặc với cái thí nghiệm này. Có nhiều việc diễn ra lạ lắm, nếu nói ra chắc chẳng ai tin.
Trước tiên là em thiết kế lại 2 cái nested primers cho final PCR. Vì trước đó em dùng cùng 1 cặp primer cho cả 2 phản ứng self-assembly và final PCR, cái này có thể là 1 trong những nguyên nhân dẫn đến rắc rối. Và nhờ thiết kế lại primer, em giảm nhiệt độ bắt cặp trong final PCR xuống còn 50 0C.
Từ đó về sau thì final pcr của em lúc nào củng có band, chỉ có điều là độ sáng rất yếu (hàm lượng rất thấp).
Nhưng điều quan trọng nhất là kết quả ko ổn định. Em ko biết nói ra có ai tin không. Nhưng cùng một mẫu digested DNA (fragment), sau khi chạy self-assembly thì kết quả lại khác nhau thậm chí hôm nay em còn thu phải một cái band tạp bự hơn cái band mong muốn. Cái này em bó tay, chẳng biết giải thích như thế nào. Em đang nghĩ phải chăng fragment trữ trong -20 0C có khi không bền???
GS cũng đồng ý với việc đánh giá nồng độ sản phẩm self-assembly trước khi đưa vào final pcr. Em đang thử cái vụ này.
Em chào anh.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Anh Hiếu,
Cảm ơn anh đã quan tâm. Em vẫn đang trục trặc với cái thí nghiệm này. Có nhiều việc diễn ra lạ lắm, nếu nói ra chắc chẳng ai tin.
Trước tiên là em thiết kế lại 2 cái nested primers cho final PCR. Vì trước đó em dùng cùng 1 cặp primer cho cả 2 phản ứng self-assembly và final PCR, cái này có thể là 1 trong những nguyên nhân dẫn đến rắc rối. Và nhờ thiết kế lại primer, em giảm nhiệt độ bắt cặp trong final PCR xuống còn 50 0C.
Từ đó về sau thì final pcr của em lúc nào củng có band, chỉ có điều là độ sáng rất yếu (hàm lượng rất thấp).
Nhưng điều quan trọng nhất là kết quả ko ổn định. Em ko biết nói ra có ai tin không. Nhưng cùng một mẫu digested DNA (fragment), sau khi chạy self-assembly thì kết quả lại khác nhau thậm chí hôm nay em còn thu phải một cái band tạp bự hơn cái band mong muốn. Cái này em bó tay, chẳng biết giải thích như thế nào. Em đang nghĩ phải chăng fragment trữ trong -20 0C có khi không bền???
GS cũng đồng ý với việc đánh giá nồng độ sản phẩm self-assembly trước khi đưa vào final pcr. Em đang thử cái vụ này.
Em chào anh.

1. Vay la digestion co van de? Enzyme RE va DNA co thay doi gi so voi lan dau tien k? Em co lam thu cac digestion o cac tube khac nhau trong cung 1 dk roi chay self-assemply xem kha nang lap lai hieu suat cat ntn?

2. Co le em thu tinh sach self-assemply = kit tinh sach san pham PCR truoc khi chay final PCR di.

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Chào anh Hiếu,
2. Co le em thu tinh sach self-assemply = kit tinh sach san pham PCR truoc khi chay final PCR di.
Tinh sạch trước khi chạy pcr kết quả có phần tốt hơn trước lúc tinh sạch. Cảm ơn anh.