Tinh sạch enzyme.

[Phạm Ngọc Dương]

Tôi đang được giao nghiệm vụ tinh sạch một hỗn hợp Enzyme một cách hiệu quả và kinh tế nhất
hỗn hợp đó gồm có các enzyme sau
A :la loại enzyme có Pi=11 khối lưọng 20.000Da
B : pI= 4.5 khối lượng 60.000Da
C PI=4.5 360.000Da
D: pi=5 360.000Da và đặc hiệu Asp
Hiên nay tôi chưa biết nhiều về cách tinh sạch enzyme.Các bạn có thể giúp tôi đưa ra một mô hình tối ưu nhất nếu gặp trương hợp trên.Hay cung cấp cho tôi một số hiểu biết về các phương pháp tinh sạch enzyme như sắc kí lọc gel ,sắc kí ái lực,điên di,hoặc kết tủa ....Và phạm vi ứng dụng của nó trong sản xuất.

 

[shortgun]

Tớ có thể bàn luận với cậu về vấn đề này, kể cả ở quy mô công nghiệp, nhưng trước hết cậu hãy học lý thuyết đi đã

 

[Phạm Ngọc Dương]

Tơ đa tìm hiểu về vấn dề này rồi đấy chứ,và tớ cũng đã được thực hiện một số phuơng pháp tách và tinh sạch enzyme như điện di ,săc kí ,dùng kêt tủa ..nhưng tớ mới chỉ thực hiện trong phòng thi ngiệm thôi .Tơ muấn biết về khả năng ứng dụng của nó trong công nghiệp và khi thực hiện trên quy mô lớn thì nó khác gì so vơi trong phòng thí nghiệm.

 

[Phạm Ngọc Dương]

Tôi có thể tách hỗn hợp trên như sau được không
đầu tiên tôi dùng dung dịch muối trung tính có PH=4,5 để tách hai enzym B và C
sau đó tôi dùng sắc kí lọc gel để tách B ra khỏi C
dùng sắc kí ái lực với dăc hiệu Asp để tách A Và D ra khỏi nhau.
Vấn đề là tôi vẫn chưa hình dung ra được bằng cách nào để gắn dặc hiệu Asp vào cột gel ,tôi chưa được thực hiện phương pháp này bao giờ .
Và nếu thực hiện các phương pháp trên dể tách hỗn hợp enzym thi trong sản xuất người ta gắn kết các quá trình làm sao để quá trình tách thành một hệ thống.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

nếu biết pI và khối lượng phân tử rồi thì chạy điện di 2 chiều là hợp lý nhất
không biết rõ về tinh sạch enzyme lắm nên tôi chỉ góp được có thế.
Xin hỏi enzyme tách chiết như trên thì còn gì hoạt tính nữa? Có lẽ cứ phải sắc ký ái lực, sắc ký lỏng cao áp thôi.
Mà câu hỏi trên có vẻ như bạn phải vạch ra kế hoạch thay vì làm thực. Nếu vậy thì đọc thêm sách về các kỹ thuật sinh hóa rồi quyết định cho mình thôi. Tôi tin nếu bạn chịu khó đọc lâu lâu một chút sẽ trở thành expert in the field ngay
cheer!

 

[Phạm Ngọc Dương]

Drosophilia cảm ơn bạn dã góp ý ,bạn noi đúng câu hỏi trên của tôi chi là một tình huống mà tôi nghĩ ra thôi .thực sự enzyme không phải là một chuyên ngành học của tôi,nhưng khi tìm hiểu về enzym tôi cảm thay rất thích tôi thấy có nhiều điều thú vị trong đó .Và tôi thực sự muấn biêt về cái cách mà người ta thu được những chế phẩm enzyme tinh sạch từ những nguần cung cấp enzyme thưc vật hay từ nuôu cấy vi sinh vật.Để có được những chế phẩm enzyme chất lương cao dùng trong công nghiệp thực phẩm như protêase trong sản xuất nước mắm nhanh chẳng hạn.
vì thế ban nào biết gì về vấn đề này ,hay nhưng tài liệu có liên quan hãy giúp đỡ tôi nhé.Cảm ơn các bạn nhiều !

 

[shortgun]

đầu tiên tôi dùng dung dịch muối trung tính có PH=4,5 để tách hai enzym B và C

Cậu dùng pp kết tủa hay sắc ký trao đổi ion?

sau đó tôi dùng sắc kí lọc gel để tách B ra khỏi C

Tách B ra khỏi C, D?

Vấn đề là tôi vẫn chưa hình dung ra được bằng cách nào để gắn dặc hiệu Asp vào cột gel ,tôi chưa được thực hiện phương pháp này bao giờ

Đặt hàng thứ người ta đã làm sẵn. Nếu không có, co thể tham khảo các sách vở khác,
các methods của các article liên quan tới đề tài, tự xây dựng protocol.

Và nếu thực hiện các phương pháp trên dể tách hỗn hợp enzym thi trong sản xuất người ta gắn kết các quá trình làm sao để quá trình tách thành một hệ thống

Để tối ưu hóa một công nghệ tinh sạch E, người ta có thể lấy nhiều thông số khác nhau làm cơ sở: hiệu suất thu hồi, họat tính E, vốn đầu tư, hiệu quả sử dụng dung môi ...
Thông số để gắn kết các công đọan là nhiệt độ, pH, họat lực ion, nồng độ họat chất ...

nếu biết pI và khối lượng phân tử rồi thì chạy điện di 2 chiều là hợp lý nhất
không biết rõ về tinh sạch enzyme lắm nên tôi chỉ góp được có thế.
Xin hỏi enzyme tách chiết như trên thì còn gì hoạt tính nữa? Có lẽ cứ phải sắc ký ái lực, sắc ký lỏng cao áp thôi.

:?

vì thế ban nào biết gì về vấn đề này ,hay nhưng tài liệu có liên quan hãy giúp đỡ tôi nhé.Cảm ơn các bạn nhiều

Cậu đọc thêm về biochemical separtion methods và downstream processing nha :|

 

[Phạm Ngọc Dương]

Cậu dùng pp kết tủa hay sắc ký trao đổi ion?

Ý Của tớ là dùng dung dịch muối trung tính như (NH4)2SO4 để tách hỗn hợp ban đầu thành hai hỗn hợp nhỏ bằng cách kết tủa,bước này làm ở điều kiện nhiệt độ lạnh vì enzyme rât dễ bị biến tính.
hỗn hợp thứ nhất gồm hai enzyme B VÀ C
hỗn hợp thứ hai gồm A VÀ D
Sau đó tớ sẽ dùng các phương pháp sắc kí lọc gel để tảch rời B va C sắc kí ái lưc với dặc hiệu Asp để tách rời A VÀ D.
Tớ nghĩ dùng các biện pháp kết tủa tạm thời vẫn có thể dữ đươc hoạt tínhh enzyme chứ?
Shortgum những tài liệu cậu nói tớ có thể tìm thấy ở đâu vậy?
Cảm ơn cậu nhé!

 

[purin]

Tớ không biết rành lắm, nhưng có thể tách ênzym dựa trên trọng lượng phân tử. Có thể dùng sắc ký cột để phân tách dựa trên TLPT, sẽ thu được các phân đọan có ênzym cần thiết. Để biết có đúng không thì cậu chạy điện di SDS-PAGE. Tuy nhiên, đối với 2 ênzym có cùng TLPT nhưng pH khác nhau như C và D thì tớ không biết

 

[Cao Xuân Hiếu]

Hình như chúng ta đang "đánh trận trên giấy" rồi. Nếu đặt ra vấn đề như trên chỉ đúng với phân lập (tinh sạch) các protein thôi. Nếu muốn tinh sạch enzyme hoạt tính lại còn trên quy mô công nghiệp nữa thì chậc chậc ...
Theo tôi 1) trong một quy trình thì ng ta chỉ ưu tiên 1 loại enzyme thôi, cần 2) biến đổi một số đặc tính của enzyme để thuận tiện cho tinh sạch (thích nhất là tìm được nguồn enzyme chịu lạnh hoặc chịu nhiệt) ... Trong lĩnh vực này ng ta ko cố gắng giải các bài toán theo kiểu bài tập di truyền trong sách luyện thi đại học mà phải sáng tạo và tìm ra hướng cải thiện tình hình nhiều hơn. Ý tưởng là tiền mà.

 

[shortgun]

Ý Của tớ là dùng dung dịch muối trung tính như (NH4)2SO4 để tách hỗn hợp ban đầu thành hai hỗn hợp nhỏ bằng cách kết tủa,bước này làm ở điều kiện nhiệt độ lạnh vì enzyme rât dễ bị biến tính.
hỗn hợp thứ nhất gồm hai enzyme B VÀ C
hỗn hợp thứ hai gồm A VÀ D

Thế cậu không nghĩ là D sẽ kết tủa cùng với B và C?

Tớ nghĩ dùng các biện pháp kết tủa tạm thời vẫn có thể dữ đươc hoạt tínhh enzyme chứ?

Pp kết tủa được ứng dụng rộng rãi trong tinh sạch E ở quy mô công nghiệp. Tuy nhiên ngoài NH4SO4, người ta còn dùng nhiều cách khác như dung môi hữu cơ, acid, các chất cao phân tử, acid dễ bay hơi ...

Shortgum những tài liệu cậu nói tớ có thể tìm thấy ở đâu vậy?

Cậu thử sục sạo trên mạng xem

Có thể dùng sắc ký cột để phân tách dựa trên TLPT, sẽ thu được các phân đọan có ênzym cần thiết

Gel filtration hay size excluded chromatography

Tuy nhiên, đối với 2 ênzym có cùng TLPT nhưng pH khác nhau như C và D thì tớ không biết

pH khác nhau tý ty như vầy thì rất khó áp dụng isoelectric precipitation hay ion exchange chromatography. Nên dùng affinity chromatography hay pp khác.

biến đổi một số đặc tính của enzyme để thuận tiện cho tinh sạch

Thực tế người ta đã gắn thêm những đoạn peptide sử dụng ion exchange chromatography hay affinity chromatography.

thích nhất là tìm được nguồn enzyme chịu lạnh hoặc chịu nhiệt

Một trong những hướng nghiên cứu của enzymology trên thế giới hiện nay

Trong lĩnh vực này ng ta ko cố gắng giải các bài toán theo kiểu bài tập di truyền trong sách luyện thi đại học mà phải sáng tạo và tìm ra hướng cải thiện tình hình nhiều hơn. Ý tưởng là tiền mà

:?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

có ai giải thích được cơ chế gây kết tủa của các muối như amonium sulfate đối với protein hoặc acetone đối với protein không? Tôi chỉ nhớ hồi xưa thì ông thầy nói là nó giảm hằng số điện của dung môi nên làm cho protein kết tủa theo kiểu kỵ nước. Không thỏa đáng lắm nên tôi muốn hỏi thêm. Cám ơn trước

 

[shortgun]

có ai giải thích được cơ chế gây kết tủa của các muối như amonium sulfate đối với protein hoặc acetone đối với protein không? Tôi chỉ nhớ hồi xưa thì ông thầy nói là nó giảm hằng số điện của dung môi nên làm cho protein kết tủa theo kiểu kỵ nước. Không thỏa đáng lắm nên tôi muốn hỏi thêm. Cám ơn trước

Cau xem lai co che "salting out and salting in"

 

[Thành viên cũ]

Tro lai " bai toan" cua kinghong_d ma chung ta can gia quyet. Khong biet ban da tim ra cach giai chua? Nhung theo toi, thuc su day la mot bai toan thuan tuy ve ly thuyet. Con thuc nghiem cu bat tay vao khao sat tach va lam sach bang cac phuong tien ban co ban se co mot qui trinh phu hop va chap nhan duoc trong dieu kien phong thi nghiem cua ban. So di toi noi day la mot bai toan li thuyet vi trong dich chiet tho khong chi co A, B, C, D (A. B. C. D là enzym gi, ban neu chi tiet moi nguoi se gop y cho ban cu the va sat thuc hon, vi ngoai nhung tinh chat ban neu chac chan chung con co nhieu diem khac biet de chung ta loi dung tach chung ra khoi nhau ).
Voi bai toan cua ban, nen chang tach theo qui trinh sau:
Truoc het ban loai bo A ra khoi hon hop bang cach ket tua dang dien (chinh pH ve 4,5).
Sau do dung sac ki loc gel Sephadex (G75 chang han, cho nhanh) de loai B, co the ban se thu duoc mot hon hop C, D ngay tu nhung phan doan dau tien!!!. Sau do neu C, D chua tach duoc ban cho qua trao doi ion, nhat dinh ban se thu duoc D (co le day la muc tieu cua ban, vi ban cung cap them mot dac tinh nua cua D, co ai luc voi Asp).
Ban co the tach theo cach khac va hay bat tay vao lam di, ban se co phuong an toi uu ma khong can phai doi den ngay co duoc copt ai luc dau.
Chuc thanh cong !

 

[liquid]

- Tui đồng ý với ý kiến của một số người, câu hỏi này chung chung qua, hinh như hơi giống hóa cấp III, tách và nhận biết một số chất, và đến bây giờ mình thấy những bài toán dạng đấy chỉ mang tính chất đánh đố chứ chẳng có tí gì là thực tiễn cả. Trong trường hợp này khác nhau cơ bản là khối lượng và Pi nên có thể dùng các phương pháp sau:li tâm, lọc gel, thay đổi pH, thay đổi lực ion hoặc giảm hằng số điện môi.
- Về vấn đề kết tủa bằng muối (NH4)2SO4 hoặc các muối khác, nguyên nhân là do trong dung dịch, phần kị nước của các phân tử protein(các R của axit amin: Ala,Trp,Pro,Leu, Ile, Met, Val, Phe) bị các phân tử nước bao quanh, nên các phân tử ko thể kết dính lại với nhau được. Khi ta cho (NH4)2SO4 vào thì các phân tử protein một phần được giải phóng khỏi các phân tử nước (dehydration) và giữa chúng xuất hiện hydrophobic liên kết, kết dính vào nhau tạo thành một khối, tính tan của protein giảm đột ngột và kết tủa. Nồng độ của muối càng cao thì quá trình xảy ra càng nhanh. Đối với các protein chứa ít hydrophobic R, chúng sẽ không kết tủa hoặc kết tủa rất chậm. Ko biết có thiếu gì ko, góp ý nhé!

 

[Nguyễn Văn Hưng]

hiên nay theo tôi được biết phương phap tinh sach enzym hữu hiệu nhất hiện nay tinh sach enzym băng công nghệ màng lọc nếu muôn tim hiêu sâu về vấn đề nay ban đt 090382271 chuyên gia về lĩnh vực này .
chúc bạn thành công

 

[kimthy]

mình cũng đang làm bài báo cáo về tinh sạch enzyme lactase. sau khi qua nhiểu giai đoạn như ly tâm, siêu lọc..còn khâu tinh sạch cuối cùng là trao đổi ion. nhưng mình đang bế tắc. không biết nên chọn ionic nào? pH? còn khâu rửa giải nữa chứ. có ai biết không? giúp mình với. thanks!

 

[Nguyễn Duy Hưng]

Bạn làm b-galactosidase hả. Mình đã từng làm sắc ký với cột DEAE-Cellulose, elute với gradient NaCl (0 - 0.5M). Độ thu hồi cũng tương đối.