Tinh chế đoạn có kích thước từ 10-50 bp từ gel agarose 5%

[thanhtam_2601]

Có bác nào biết kit hoặc cách để tinh chế đoạn DNA có kích thước 10-50bp từ gel agarose không? Em cắt DNA bằng DNase I sau đó thu được một dải kích thước khác nhau và chỉ cần đoạn kích thước nhỏ thôi nhưng thu bằng các kit tinh chế DNA thông thường thì DNA nhỏ bị trôi đi hết.

 

[Ho Huu Tho]

Thử với tách chiết bằng phenol/chloroform và tủa bằng cồn xem có được không?

 

[thanhtam_2601]

Nhưng DNA phải tách ra từ gel agarose 5% thì làm cách nào mà dùng được cách này?
Mình có biết một loại giấy được đặt vào agarose sau đó mà thu DNA kích thước nhỏ này bằng cách điện di nhưng chỉ sử dụng cho 1 thí nghiệm nhỏ đặt mua cũng tốn kém mà chưa chắc ở VN đã có bán nên muốn tìm ra 1 cách nào hiệu quả hơn.

 

[nvhung]

Nhưng DNA phải tách ra từ gel agarose 5% thì làm cách nào mà dùng được cách này?
Mình có biết một loại giấy được đặt vào agarose sau đó mà thu DNA kích thước nhỏ này bằng cách điện di nhưng chỉ sử dụng cho 1 thí nghiệm nhỏ đặt mua cũng tốn kém mà chưa chắc ở VN đã có bán nên muốn tìm ra 1 cách nào hiệu quả hơn.

Bạn thử dùng Kit của hãng này đi.http://store.biobasic.com/product/bs353-size-50preps/
Chất lượng tốt mà giá lại mềm. Nó có loại bỏ những đoạn nhỏ hơn 40Bp.
Nếu bạn có nhu cầu liên hệ với mình nha:

TBR CORPORATION
Head Office: 133/21 Do Xuan Hop Street, Ward Phuoc Long B, District 9, Ho Chi Minh City, Viet Nam
Mail: sales@tbr.vn

 

[cfareast]

Có bác nào biết kit hoặc cách để tinh chế đoạn DNA có kích thước 10-50bp từ gel agarose không? Em cắt DNA bằng DNase I sau đó thu được một dải kích thước khác nhau và chỉ cần đoạn kích thước nhỏ thôi nhưng thu bằng các kit tinh chế DNA thông thường thì DNA nhỏ bị trôi đi hết.

Vấn đề bạn cần tách hay tinh sạch để làm tiếp cái gì? Có nhất thiết phải làm sạch không? Cứ hãy thử với DNA không sạch trước đã. Nếu chỉ để ligation, cloning thì chẳng cần sạch lắm , hiệu suất giảm cũng không sao?

 

[thanhtam_2601]

Cảm ơn các bạn trả lời câu hỏi giùm mình. Sản phẩm thu về mình sẽ sử dụng tiếp làm PCR nhưng vì hiệu quả thu những đoạn kích thước nhỏ quá thấp nên khi lượng DNA đầu vào phải sử dụng nhiều nên rất tốn mẫu. Mình sẽ cân nhắc để làm tiếp.

 

[cfareast]

Cảm ơn các bạn trả lời câu hỏi giùm mình. Sản phẩm thu về mình sẽ sử dụng tiếp làm PCR nhưng vì hiệu quả thu những đoạn kích thước nhỏ quá thấp nên khi lượng DNA đầu vào phải sử dụng nhiều nên rất tốn mẫu. Mình sẽ cân nhắc để làm tiếp.

Mình chưa search xem có kít tinh sạch đoạn kích thước bé không?

Nhưng theo tôi, đơn giản và hiệu quả nhất là cứ cắt DNA band, rồi làm tan, hòa loãng 100X hay 1000x gì đó mà run PCR.

Các chất tạp sẽ bị loãng, và không ảnh hưởng đến hiệu quả nhân gien.

Tôi đã chạy PCR nước cất đục ngầu vì nhiễm vi sinh (do sơ suất), nhưng băng đặc hiệu vẫn nét căng...

quan trọng nhất vẫn là template, primer và nhiệt độ... những thứ khác là phụ. Nếu cần thiết thì đặt polymerase xịn vào là xong.

Suýt quên, người ta vẫn lấy khuẩn lạc, tách plasmid và lấy supernatant dùng chạy PCR luôn, đâu cần phải tinh sạch. Trong đó tỉ thứ chất linh tinh
good luck

 

[nthanh]

Có bác nào biết kit hoặc cách để tinh chế đoạn DNA có kích thước 10-50bp từ gel agarose không? Em cắt DNA bằng DNase I sau đó thu được một dải kích thước khác nhau và chỉ cần đoạn kích thước nhỏ thôi nhưng thu bằng các kit tinh chế DNA thông thường thì DNA nhỏ bị trôi đi hết.

Bạn thử cắt băng, hòa băng đó bằng đệm của các kit cột bạn đang dùng đó, sau đó tủa bằng phương pháp như Bạn Hồ Hữu Thọ nói xem sao "Thử với tách chiết bằng phenol/chloroform và tủa bằng cồn xem có được không?" mình thấy các kít hiện nay dùng cột thì họ bảo thu được kích thước từ 50 bp nên mình nghĩ tủa là tốt nhất, thu được tất cả luôn.

 

[thanhtam_2601]

Cách này mình đã thử trước đó rồi nhưng có vấn đề vì agarose cũng bị tủa theo và tạo thành một khối màu trắng lớn. Trong mấy cái kit nó không đề cập đến vấn đề này luôn nên thử rồi mới biết.

 

[Ho Huu Tho]

Bạn thử xem xét khả năng thay điện di trên gel agarose bằng điện di đứng trên gel polyacrilamide. Tách các đoạn kích thước nhỏ như vậy từ gel polyacrilamide có thể sẽ khả thi hơn.
Gửi bạn trang này để tham khảo: http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=1223

 

[nthanh]

Mình thắc mắc chút về chạy PCR với các đoạn >50 bp, bạn có thể giải thích chút được không?

Mình chợt nảy ra ý là sao bạn không dùng cột để giữ tất cả các đoạn >50 bp (bỏ đi) và thu dịch ly tâm chứa các đoạn <50 bp. Sau đó tủa cồn để thu tủa cho nồng độ cao khi hòa trong TE lượng ít, nhưng thật sự là cái ranh giới 50 bp làm mình thấy hơi lo

 

[thanhtam_2601]

Đầu tiên các đoạn DNA với kích thước 1.5kb được cắt ra bằng DNase I một cách ngẫu nhiên thành các đoạn có kích thước nhỏ sau đó đem điện di trên gel agarose và chỉ thu lại các đoạn có kích thước nhỏ khoảng 10-50bp ( tốt nhất là các đoạn 10-25bp) để thực hiện tiếp phản ứng PCR.Đây là quá trình tạo ra các chimeric DNA từ một số DNA gốc ban đầu.
Mình sẽ thử cách điện di trên polyacrylamide - thực sự lab mình cũng chưa thử chạy DNA trên polyacrylamide nên không biết có đủ hóa chất để sử dụng không nữa

 

[cfareast]

Mình thắc mắc chút về chạy PCR với các đoạn >50 bp, bạn có thể giải thích chút được không?

Mình chợt nảy ra ý là sao bạn không dùng cột để giữ tất cả các đoạn >50 bp (bỏ đi) và thu dịch ly tâm chứa các đoạn <50 bp. Sau đó tủa cồn để thu tủa cho nồng độ cao khi hòa trong TE lượng ít, nhưng thật sự là cái ranh giới 50 bp làm mình thấy hơi lo

Bác này có vẻ đọc không kỹ câu hỏi, hay nhận thức ko được rõ:

Những chỗ quote chữ đỏ bác nên xem lại:
- "tất cả các đoạn >50 bp". xin thưa là khi cắt gel, thì chủ thớt đã loại tất cả các đoạn lớn và nhỏ đi rùi, chỉ giữ lại kích thước cần quan tâm
- "Tủa cồn để thu tủa" Câu này của bác cũng có vấn đề, vì tôi ko sure là kích thước 50bp thì bị tủa trong cồn... Cái này cần kiểm chứng.

Chủ thớt ở đây muốn loại bỏ agar, buffer TE, hay chất nhuộm DNA..., vì khi cắt gel, sẽ có những chất trên song hành cùng DNA 50bp.
Để chạy PCR thì cứ hòa loãng DNA cũng tạm được. Nếu không lên DNA band, thì mới cần optimize các điều kiện.

 

[nthanh]

Bác này có vẻ đọc không kỹ câu hỏi, hay nhận thức ko được rõ:

Những chỗ quote chữ đỏ bác nên xem lại:
- "tất cả các đoạn >50 bp". xin thưa là khi cắt gel, thì chủ thớt đã loại tất cả các đoạn lớn và nhỏ đi rùi, chỉ giữ lại kích thước cần quan tâm
- "Tủa cồn để thu tủa" Câu này của bác cũng có vấn đề, vì tôi ko sure là kích thước 50bp thì bị tủa trong cồn... Cái này cần kiểm chứng.

Chủ thớt ở đây muốn loại bỏ agar, buffer TE, hay chất nhuộm DNA..., vì khi cắt gel, sẽ có những chất trên song hành cùng DNA 50bp.
Để chạy PCR thì cứ hòa loãng DNA cũng tạm được. Nếu không lên DNA band, thì mới cần optimize các điều kiện.

Hi bạn,
Mình nghĩ mình không hiểu nhầm gì cả. Ở đây ý mình bảo là bạn ý dùng cột để loại bỏ DNA >50 bp (bằng cột), DNA này thì là DNA từ phản ứng cắt bằng RE của bạn chủ thớt chứ mình không bảo là từ gel điện di. Cái cột đó nó giữ được DNA > 50 bp nên cái dịch ly tâm bạn thu được sẽ là DNA < 50 bp như ý bạn chủ muốn.
Còn tủa cồn được hay không thì phải thử thôi, làm thì nghiệm thì phải thử chứ, phải không nhỉ. quan trọng là có ý tưởng hay không thôi. Hơn nữa, mấy cột lọc ly tâm thu DNA hiện nay các bạn có thể tái sử dụng nhiều lần nên có gì đâu mà không thử.

@ Bác chủ, bác thử cách của bạn Thọ thì đưa kết quả lên cho mọi người tham khảo nhé.