Biểu hiện gen trên E. coli hay nấm men?

[Trịnh Thị Hồng Nhung]

Câu hỏi của em là biểu hiện gen trên E. coli thì có ưu nhược điểm gì và tương tự trên nấm men. Và kèm theo các câu hỏi nhỏ như:
- tại sao protein của Eukaryote chỉ có hoạt tính khi ở dạng đường hóa (glycosylated)?
- trong một công trình nghiên cứu em đang xem, người ta biểu hiện gen mã hóa protein của virus cúm H5N1 lên E. coli để nghiên cứu mức độ biểu hiện protein này rồi sau đó lại chuyển gen tái tổ hợp vào nấm men. Không hiểu mục đích là gì mà họ không biểu hiện luôn trong nấm men?
Mong sớm được trả lời để tối nay nộp tiểu luận cho thầy )

 

[Trịnh Thị Hồng Nhung]

trong diễn đàn cũng có rồi, tuy chưa đầy đủ
http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=7157&page=2

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

"trong một công trình nghiên cứu em đang xem, người ta biểu hiện gen mã hóa protein của virus cúm H5N1 lên E. coli để nghiên cứu mức độ biểu hiện protein này rồi sau đó lại chuyển gen tái tổ hợp vào nấm men. Không hiểu mục đích là gì mà họ không biểu hiện luôn trong nấm men?"

Trả lời giúp bạn câu này thôi. Các câu khác tự kiếm tài liệu nhé.

Người ta thường biểu hiện 1 gene trong cả E.coli lẫn nấm men bởi vì nếu sử dụng protein do gene đó mã hóa làm vaccine thì bạn không thể dùng E.coli được. Nếu biểu hiện ở nấm men thì 'tam được' hơn vì nhiều lý do:
+ biểu hiện ở nấm men 'an toàn' hơn
+ biểu hiện ở nấm men cho protein có cấu trúc gần giống với protein gốc hơn
+ biểu hiện ở nấm men có thể tiết ra ngoài môi trường để tinh sạch dễ hơn
Tuy nhiên người ta vẫn biểu hiện gene này ở E.coli (trước hay sau không quan trọng) vì vài lý do sau:
+ Bạn cần tạo kháng thể cho protein này (E.coli biểu hiện mạnh và nhanh hơn, nếu có đuôi His sẽ dễ tinh sạch và tiêm chuột lấy kháng thể)
+ Bạn cần định lượng protein biểu hiện ở nấm men
+ Bạn không thể gắn các Tag tinh sạch vào protein ở nấm men khi bạn muốn sản phẩm của mình được cơ quan có thẩm quyền chấp nhận
+ Bạn cần antigen để coat ELISA khi kiểm tra huyết thanh chuột được tiêm bằng protein tinh sạch từ nấm men. Bạn cần một lượng đủ lớn, và sạch. Bạn vẫn có thể biểu hiện protein này với đuôi His ở nấm men rồi tinh sạch. Tuy nhiên quy trình sẽ vất vả hơn và có nguy cơ protein tạp từ nấm men sẽ làm nhiễu kết quả đọc ELISA.

 

[Nguyễn Thy Ngọc]

"+ Bạn cần định lượng protein biểu hiện ở nấm men
+ Bạn không thể gắn các Tag tinh sạch vào protein ở nấm men khi bạn muốn sản phẩm của mình được cơ quan có thẩm quyền chấp nhận
+ Bạn cần antigen để coat ELISA khi kiểm tra huyết thanh chuột được tiêm bằng protein tinh sạch từ nấm men. Bạn cần một lượng đủ lớn, và sạch. Bạn vẫn có thể biểu hiện protein này với đuôi His ở nấm men rồi tinh sạch. Tuy nhiên quy trình sẽ vất vả hơn và có nguy cơ protein tạp từ nấm men sẽ làm nhiễu kết quả đọc ELISA."

Anh Lương có thể vui lòng giải thích rõ hơn về 3 điểm này được không ạ! Cảm ơn anh!!

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Định lượng protein biểu hiện ở nấm men:
+ Nếu protein ở nấm men có thể tinh sạch thì so sánh các băng SDS-PAGE với nhau (băng biểu hiện ở nấm men vs băng biểu hiện ở E.coli). Nếu không thể tinh sạch protein biểu hiện ở nấm men, thì phải so sánh bằng phương pháp so màu (Western, ELISA). Thông thường biểu hiện ở E.coli khá dễ và cho protein biểu hiện ở lượng rất lớn. Protein này có thể được dùng để tạo kháng thể từ chuột (rồi kháng thể này sẽ được dùng để phát hiện protein biểu hiện ở nấm men bằng Western hoặc ELISA), hoặc dùng trực tiếp để so sánh với protein biểu hiện ở nấm men (thường nếu có tinh sạch được lượng sẽ ít hơn và không nhiều).

+ Một số vaccine tái tổ hợp ở nấm men đã được cơ quan có thẩm quyền chấp nhận (hình như là hepatitis B). Nếu muốn được chấp nhận thì các vaccine tái tổ hợp này nói chung là không nên chứa các tag tinh sạch (kể cả nhỏ như Histag).

+ Điều thứ ba (quay lại điều 1).

 

[Trịnh Thị Hồng Nhung]

"
+ biểu hiện ở nấm men có thể tiết ra ngoài môi trường để tinh sạch dễ hơn

Vậy tại sao thực tế tách chiết, tinh sạch protein biểu hiện ở nấm men vẫn khó khăn hơn ở E. coli?

Định lượng protein biểu hiện ở nấm men:
Nếu không thể tinh sạch protein biểu hiện ở nấm men, thì phải so sánh bằng phương pháp so màu (Western, ELISA).
+ Một số vaccine tái tổ hợp ở nấm men đã được cơ quan có thẩm quyền chấp nhận (hình như là hepatitis B). Nếu muốn được chấp nhận thì các vaccine tái tổ hợp này nói chung là không nên chứa các tag tinh sạch (kể cả nhỏ như Histag).

Nếu không được gắn tag thì làm thế nào để tinh sạch trong sản xuất vaccin ạ?
Mong không bị chê là lười không chịu tìm tài liệu vì là được trả lời thì dễ hiểu hơn.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Vậy tại sao thực tế tách chiết, tinh sạch protein biểu hiện ở nấm men vẫn khó khăn hơn ở E. coli?

Từ dễ tinh sạch hơn ở đây là nói đến trường hợp trong cùng một đối tượng (E.coli, nấm men, tế bào động/thực vật) so sánh giữa biểu hiện nội bào và ngoại bào, và đặc biệt khi bạn không dùng tag. Trường hợp không có tag thì quên chuyện tinh sạch nội bào luôn đi vì giữa vô vàn protein tạp như vậy khó mà lọc ra riêng được protein của bạn. Nếu là ngoại bào thì số protein tạp ít hơn rất nhiều và nếu không có tag vẫn có thể tinh sạch protein của bạn bằng FPLC cổ điển (trao đổi ion, lọc gel).

Nếu không được gắn tag thì làm thế nào để tinh sạch trong sản xuất vaccin ạ?

Một số bài báo tôi đọc họ dùng sắc ký ái lực. Trong đa số các nghiên cứu proof of concept (tức là chỉ chứng minh protein đó có làm vaccine được không chứ không nói đến chuyện sẽ sản xuất hàng loạt để sử dụng) thì người ta vẫn sử dụng tag và sắc ký ái lực. Một vài bài sử dụng sắc ký cột cổ điển (trao đổi ion, lọc gel).

Nói chung quy trình để bạn tìm ra 1 vaccine tái tổ hợp thường là:
+ epitope mapping ở E.coli (tức bạn biểu hiện các đoạn khác nhau của 1 protein vỏ virus/vi khuẩn ở E.coli rồi tiêm vào chuột và so sánh mức độ tạo kháng thể khác nhau đối với protein vỏ ban đầu, cũng như khả năng tạo kháng thể có thể trung hòa virus). Lý do làm ở E.coli là vì quy trình rất nhanh và dễ làm. Bạn vẫn có thể sử dụng nguyên protein gốc để làm vaccine nhưng như vậy sẽ hạn chế nhiều phương pháp biểu hiện nó nếu protein gốc quá lớn.

+ chọn được neutralizing epitope. Sau đó bạn sẽ sản xuất antigen tương ứng với epitope này ở E.coli để dùng cho các thí nghiệm về sau (sản xuất antibody cho antigen này, dùng antigen để định lượng và định tính vaccine sản xuất ở đối tượng mong muốn của bạn).

+ biểu hiện antigen ở đối tượng ưa thích (nấm men, tế bào động thực vật hay côn trùng)

 

[Trịnh Thị Hồng Nhung]

Cảm ơn bác nhiều. Cho em hỏi câu này nữa
* Điều gì quyết định protein được sản xuất ra là nội bào và ngoại bào, có phải do một protein khác điều khiển hoạt động bài tiết protein đó không.
Theo em thấy thì các enzyme thủy phân thường được tiết ngoại bào, do đó người ta gắn gen biểu hiện protein vào gần gen biểu hiện enzyme (như trong sản xuất insulin, gắn gen này vào đoạn cuối gen sản xuất beta-galactosidase, để insulin bài tiết ra cùng enzyme này).
Nếu đúng như vậy thì ngoại bào hay nội bào không phụ thuộc vào biểu hiện trên đối tượng nào mà phụ thuộc vào vị trí biểu hiện trong plasmid/ gen?

 

[meodungmeo]

Cảm ơn bác nhiều. Cho em hỏi câu này nữa
* Điều gì quyết định protein được sản xuất ra là nội bào và ngoại bào, có phải do một protein khác điều khiển hoạt động bài tiết protein đó không.
Theo em thấy thì các enzyme thủy phân thường được tiết ngoại bào, do đó người ta gắn gen biểu hiện protein vào gần gen biểu hiện enzyme (như trong sản xuất insulin, gắn gen này vào đoạn cuối gen sản xuất beta-galactosidase, để insulin bài tiết ra cùng enzyme này).
Nếu đúng như vậy thì ngoại bào hay nội bào không phụ thuộc vào biểu hiện trên đối tượng nào mà phụ thuộc vào vị trí biểu hiện trong plasmid/ gen?

Theo kiến thức của em là khi nghiên cứu 1 gen, gắn vào vector tách dòng và biểu hiện còn phải phù hợp với đoạn gắn, và chính điều này làm cho sản phẩm nội bào hay ngoại bào khó có thể khống chế.
Khi sp ở dạng nội bào thì việc nâng lên quy mô lớn sẽ không khả thi, vì thế người ta nghiên cứu bà biểu hiện chỉ tập trung vào các sản phẩm có thể biểu hiện ngoại bào.
Nếu của em có gì sai sót hay thiếu xin các anh chị giúp em ạ