Trục trặc: chiết xuất DNA từ lá cà chua

[ngoctuyen_biotech]

Em đang chiết DNA từ lá cà chua để chạy CAPS. Tuy nhiên, pellet của em sau khi tủa không phải là màu trắng mà là màu nâu xỉn, đôi khi có màu hơi đen. Em đã thử cả phương pháp SDS và CTAB nhưng kết quả vẫn thế. Bác nào có kinh nghiệm làm ơn tư vấn giúp em với.
Qui trình em làm như sau:

1. CTAB:

- Cắt 100 mg mẫu lá non, bổ sung 800µl đệm rửa (Tris-HCl 100 mM; EDTA 5 mM; Sodium metabisulfit (NaH2PO4) 0.5 %; Sorbitol 350 mM) và nghiền thành dung dịch đồng nhất, sau đó chuyển sang tube 2 ml, ly tâm 12.000 v/p trong 5 phút và loại bỏ dịch nổi (lặp lại bước này 2 lần).
- Thêm 800 ul đệm chiết (NaCl 1,5 M; EDTA 20 mM; Tris HCl 100mM; CTAB 4%) ; , sau đó ủ ở 65oC trong 1h
- Ly tâm 13000 rpm trong 5 phút, hút lấy dịch phía trên (khoảng 700 ul)
- Cho thêm 25:24:1 vào tube theo tỷ lệ 1:1 (700 ul), ly tâm 13000 rpm/5 phút ở 4oC, hút lấy dịch phía trên (khoảng 600 ul) chuyển sang tube mới.
- Cho thêm 24:1 vào tube với tỷ lệ 1:1 (600 ul), ly tâm 13000 rpm/ 5 phút ở 4oC, hút lấy dịch phía trên chuyển sang tube mới.
- Tủa bằng cồn lạnh (cồn 100 o) với tỷ lệ 2.5-3/1 để qua đêm ở -20 oChoặc isopropanol với tỉ lệ 1/1, để 15-30 phút trong tủ -20oC
- Ly tâm 13000 rpm/5 phút, đổ dịch trên thu tủa DNA, rửa lại bằng 300 ul cồn 70 o 1-2 lần, voltex sau đó ly tâm và làm khô trong không khí ở nhiệt độ phòng.
- Hòa tan DNA trong 50 ul đệm TE

2. Microprep Protocol for Extraction of DNA from Tomato and other Herbaceous Plants

1. Thu 50-100 mg mô lá non từ cây con 1-3 tuần tuổi và cho vào cối sứ lạnh
2. Chuẩn bị đệm microprep mới (xem công thức dưới đây), giữ ở nhiệt độ phòng
3. Thêm 200 ul đệm chiết và nghiền mô; thêm 550 ul đệm chiết rồi chuyển dịch nghiền vào tube 1,5 ml, vortex nhẹ nhàng hoặc lắc toàn bộ tube bằng tay.
4. Ủ trong bồn nước ở 65oC từ 30-120 phút
5. Thêm vào tube 24:1 theo tỉ lệ 1:1. Trộn đều
6. Ly tâm tube 10,000 rpm trong 5 phút
7. Hút phase dung dịch sang tube microfuge mới. Thêm 2/3-1 lần thể tích isopropanol lạnh vào mỗi tube. Đảo lộn ngược các tube cho đến khi DNA kết tủa
8. Ly tâm ngay 10,000 rpm trong 5 phút (không nhiều hơn), đổ isopropanol đi và rửa pellet bằng cồn 70 %
9. Để khô pellet bằng cách đặt các tube úp xuống mặt giấy thấm khoảng 1h hoặc, để bên cạnh máy sấy hạt giống trong 15 phút (lâu hơn nếu cần thiết)
10. Hòa tan DNA trong 50 ul TE ở 65oC trong 15 phút
11. Ly tâm 10 phút ở tốc độ 10,000 rpm, bảo quản ở 4oC tới 1 tuần, -20oC nếu cần bảo quản lâu hơn

3. SDS

Bước 1: Thu mẫu lá non ...
Bước 2: cối, chày sứ đã được khử trùng đặt trong đá lạnh, cắt 100 mg mẫu lá non vào cối
Bước 3: nhỏ 400µl dung dịch chiết tách DNA vào cối sứ rồi lấy chày nghiền nhỏ mẫu lá
Bước 4: nhỏ thêm 400µl dung dịch chiết DNA, trộn đều và chuyển 500 ml dung dịch này vào 1 tube mới
Bước 5: cho vào ống nghiệm này 700-800µl dung dịch hỗn hợp Phennol: Chloroform:Isolamylalchohol (25:24:1). Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút, trong 3 phút ở 40C rồi chuyển phần dung dịch phía trên sang ốtube mới
Bước 6: cho thêm 800µl dung dịch Chloroform:Isolamylalchohol (24:1). Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 3 phút ở 4oC, rồi chuyển phần dịch phía trên sang 1 tube mới
Bước 7: cho 800µl Ethanol tủa DNA (cồn 100 độ, lạnh), trộn đều, ủ -20oC qua đêm, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút ở 4oC. Đổ phần dung dịch phía trên, giữ lại phần kết tủa phía dưới
Bước 8: rửa kết tủa bằng Ethanol 70%, làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng.
Bước 9: hoà tan kết tủa bằng 50µl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt độ -200C.

Mô lá của em là lá non, nhưng lấy khi cây đã trưởng thành (sau trồng khoảng hơn 1 tháng, cây đã ra hoa). Nếu đây là nguyên nhân làm cho pellet bị đen thì các bác làm ơn chỉ giùm em cách làm pellet trắng mà không phải gieo lại hạt để lấy mô lá từ cây 1-3 tuẩn tuổi như qui trình 2 (Microprep) yêu cầu.

Thêm nữa, qui trình 1 (CTAB) do Lab em không có NaH2PO4 nên em không cho vào đệm rửa như qui trình yêu cầu. Lab em chỉ có KH2PO4 thôi, không biết nếu thay NaH2PO4 bằng KH2PO4 thì có ảnh hưởng gì không? Qui trình này em cũng không cho Sorbitol vào vì một anh ở Lab bảo cho thêm vào sợ làm nhớt thêm (?), như thế có đúng không? Em thấy qui trình 1 có vẻ ổn nhất vì sau khi trộn 24:1 và ly tâm thì phần dịch phía trên trong hơn chứ không có màu nâu như các qui trình khác. Tuy nhiên pellet vẫn bị nâu.

Nhân tiện các bác cho em hỏi tác dụng của các chất trong đệm rửa của qui trình 1 như sorbitol, NaH2PO4 là gì?

Em cảm ơn các bác nhiều nhiều!

 

[Cao Xuân Hiếu]

bạn đã tách thử bao nhiêu mẫu? toàn bộ mẫu nào cũng bị pellet nâu hay là có cái trắng, cái nâu? bao nhiều phần trăm bị nâu?

 

[ngoctuyen_biotech]

bạn đã tách thử bao nhiêu mẫu? toàn bộ mẫu nào cũng bị pellet nâu hay là có cái trắng, cái nâu? bao nhiều phần trăm bị nâu?

Em làm mối lần 24 mẫu, đã làm lại vài lần, toàn bộ bị nâu. Mặc dù em đã rửa bằng đệm rửa tới 3 lần. Lần nào cũng bị như vậy. DNA thì vẫn có vì em điện di vẫn có vạch bình thường, chỉ có cái là nó màu nâu, thầy bảo như thế vẫn còn bẩn lắm, phải làm lại. Em thấy có vẻ như số lần rửa càng tăng thì màu nâu càng nhạt đi, tuy nhiên cục pellet cũng nhỏ hơn. Liệu em có phải tăng số lần rửa mẫu lên nữa không? Rửa nhiều như vậy khá mất thời gian, nếu để lâu quá ở nhiệt độ phòng em sợ ảnh hưởng đến lượng DNA tổng số mình thu được. Theo Anh Hiếu thì em phải làm sao? Bọn em chiết DNA từ lúa thì dễ mà sao làm cà chua khó quá vậy trời?

 

[Cao Xuân Hiếu]

Bạn thử thay vì tăng số lần rửa pellet băng EthOH 70% thì tăng thêm số lần chiết lại 2 lần bằng 25:24:1 P:C:I và rồi vài lần 24:1 C:I cho đến khi dung dịch không màu thì mới tủa DNA.

Khi thu mẫu lá bạn có cho ngay lập tức vào nito lỏng k?

 

[ngoctuyen_biotech]

Bạn thử thay vì tăng số lần rửa pellet băng EthOH 70% thì tăng thêm số lần chiết lại 2 lần bằng 25:24:1 P:C:I và rồi vài lần 24:1 C:I cho đến khi dung dịch không màu thì mới tủa DNA.

Khi thu mẫu lá bạn có cho ngay lập tức vào nito lỏng k?

Em chỉ rửa pellet bằng EthOH 70 % 2 lần, còn đệm rửa em nói đến là khi em nghiền mẫu (tris-HCl, EDTA). Sau vài lần rửa em thấy màu của dung dịch phía trên khi cho 24:1 trong hơn nhiều (gần như trắng) so với màu nâu khi không dùng đệm rửa. Em sẽ thử chiết bằng 25:24:1 và 24:1 vài lần như gợi ý của anh xem thế nào.

Có một điều nữa là mẫu lá em thu ở xa nên sau khi thu em để trong tủ lạnh -30 một thời gian (vài tuần sau khi tập hợp đủ lượng mẫu cần thiết) rồi mới tiến hành chiết DNA. Không biết có phải đây là nguyên nhân làm cho DNA pellet của em bị đen? Để em thử thu mẫu lá tươi rồi chiết ngay xem có khá hơn không. ! Cảm ơn anh Hiếu nhiều vì đã góp ý, chúc anh và gia đình may mắn!

 

[Cao Xuân Hiếu]

Đối với pp CTAB, bạn đã thử nghiền mẫu trong nito lỏng và làm trực tiếp bước 2 (không qua bước rửa 1) chưa? Bình thường tôi ko làm bước 1 như bạn.

 

[chongiong]

Chính xác, mình nghĩ nếu bạn tách DNA lúc mới thu lá về càng sớm càng tốt. Nếu pellet nâu nhưng PCR không bị sao thì cũng ok. Có thể pha loãng DNA ra một chút cho đỡ bị ảnh hưởng.
Cái Sodium metabisulfit (hoặc Sodium bisulfit ) nên có nhưng mình thấy không cho cũng không sao nếu lá non. Cái đấy là chất khử nhẹ giúp cho pellet đỡ bị biến màu đấy

 

[ngoctuyen_biotech]

Đối với pp CTAB, bạn đã thử nghiền mẫu trong nito lỏng và làm trực tiếp bước 2 (không qua bước rửa 1) chưa? Bình thường tôi ko làm bước 1 như bạn.

Lab em không dùng nito lỏng mà nghiền trực tiếp mẫu trong đệm chiết, bọn em làm thế rất thành công với lúa và vài loại thực vật khác. Em nghĩ với cà chua cũng không có vấn đề gì.

 

[ngoctuyen_biotech]

Chính xác, mình nghĩ nếu bạn tách DNA lúc mới thu lá về càng sớm càng tốt. Nếu pellet nâu nhưng PCR không bị sao thì cũng ok. Có thể pha loãng DNA ra một chút cho đỡ bị ảnh hưởng.
Cái Sodium metabisulfit (hoặc Sodium bisulfit ) nên có nhưng mình thấy không cho cũng không sao nếu lá non. Cái đấy là chất khử nhẹ giúp cho pellet đỡ bị biến màu đấy

Cảm ơn lời khuyên của anh. Nếu ai có cách gì khắc phục hiện tượng màu pellet với mẫu đã bảo quản một thời gian trong tủ lạnh như trường hợp của em làm ơn tư vấn giúp em! Cảm ơn mọi người