Tác dụng của skim milk trong western blot?
- Thread starter paltin
- Start date
Skim milk dùng để ngăn không cho kháng thể tương tác không đặc hiệu với màng lai (những vùng không có protein của bạn). BSA cũng có tác dụng tương tự nhưng skim milk rẻ hơn nên được ưa chuộng hơn.
Nếu bạn làm Western thì gđ blocking có thể là 1h đến overnight ở RT (khoảng 25-30 độ) hoặc 4 độ.
Khi xài với kháng thể thì bạn có thể giảm nồng độ skim milk từ 5% (blocking) xuống còn 2%.
Nếu bạn làm Western thì gđ blocking có thể là 1h đến overnight ở RT (khoảng 25-30 độ) hoặc 4 độ.
Khi xài với kháng thể thì bạn có thể giảm nồng độ skim milk từ 5% (blocking) xuống còn 2%.
Không cho Tween kháng thể nó bám không đặc hiệu mạnh hơn bạn ạ. Tween dùng trong các đệm rửa cho Western và ELISA mà.
Phạm Đình Chương
Senior Member
-Thật ra nói skim milk rẻ hơn nên được ưa chuộng hơn thì không chính xác. Có nhiều kháng thể phù hợp với BSA hơn là skim milk nên dù mắc mình cũng phải dùng BSA. Khi bạn dùng skim milk cho kết quả không đẹp thì nên chuyển sang BSA để so sánh ngay.
-Thời gian cho blocking thường khoảng 1h-2h, RT hay 4 độ C đều được. Nếu bạn cảm thấy kháng thể cho background xấu thì có thể tăng thời gian blocking lên hay washing kỹ hơn.
-Thời gian cho blocking thường khoảng 1h-2h, RT hay 4 độ C đều được. Nếu bạn cảm thấy kháng thể cho background xấu thì có thể tăng thời gian blocking lên hay washing kỹ hơn.
Thông thường khi mua một loại kháng thể về lần đầu tiên để làm western blot (và không có thông tin tham khảo nên dùng bloking buffer gì từ các nguồn khác) thì sẽ dùng skim milk vì nó rẻ. Còn tất nhiên nếu lab sẵn có các loại bloking buffer khác và chuyên dùng các loại đó, cũng như không quan tâm gì đến tiền thì khác.
Nếu không có Tween để pha đệm rửa thì có thể thay bằng Triton X-100.
paltin
Senior Member
Rất cảm ơn all member,
Xin cả nhà giúp đỡ, khi mình chạy Western để ủ primary antibody 2h sau đó rửa và ủ tiếp second antibody 2h. Nhưng khi đem đi chụp thi không thấy gì, mình nghi ngờ bước chuyển màng không tốt có cánh nào kiểm tra trên màng có hay không Protein không?
Còn nếu trên màng có protein thì có thể do những nguyên nhân nào?
thanks all!
Xin cả nhà giúp đỡ, khi mình chạy Western để ủ primary antibody 2h sau đó rửa và ủ tiếp second antibody 2h. Nhưng khi đem đi chụp thi không thấy gì, mình nghi ngờ bước chuyển màng không tốt có cánh nào kiểm tra trên màng có hay không Protein không?
Còn nếu trên màng có protein thì có thể do những nguyên nhân nào?
thanks all!
Ho Huu Tho
Senior Member
Bạn tiến hành chuyển màng với những điều kiện như thế nào và kích thước protein của bạn mong đợi là bao nhiêu KDa, marker trên màng thế nào?
paltin
Senior Member
Khi chuyển màng mình để điều trong dieu kiện lạnh
Kích thước: 92, 65, 42kDa, khi chạy mình không cho marker.
Mình đã test trên màng có protein
Tiện cho mình hỏi mình ch một lúc 3 antibody thi có vấn đề gì không?
Thanks
Ho Huu Tho
Senior Member
Thời gian và hiệu điện thế bạn dùng trong chuyển màng là bao nhiêu. Mình nghĩ không nên dùng cùng lúc 3 kháng thể vì đến lúc có band sẽ không biết là có đặc hiệu hay không, band do kháng thể nào mà ra.
paltin
Senior Member
Thời gian 1h30p 100V, 500mA
Đúng là lần trước mình cói coi người bạn làm cho nhiều kháng thể vào band không rõ.
Mình có dùng ponceau red để nhuộm màng thì thấy có protein. Do đó không biết có phải do Primary anti hay Second anti hay không nữa?
Thank
Ho Huu Tho
Senior Member
Thế bạn cố định dòng hay hiệu điện thế vậy, bạn chỉ đặt được một trong hai thông số thôi mà. Màng của bạn đã ngâm trong sữa, ủ với kháng thể thì đương nhiên phải có protein rồi (phải không nhỉ). Có vẻ thời gian bạn chuyển màng hơi lâu và dòng hơi cao. Bạn có thể làm chuyển màng ở 350 mA và thời gian chuyển màng 90 phút cho protein 90 KDa, còn 45 phút cho protein 40 KDa không?
paltin
Senior Member
Thank nhiều,
Khi minh nhuộm Ponceau red thì thấy được cả các band nhưng hơi mờ.
Mình để cố định (V).
Để khi làm lại minh giam thời gian xem sao (nhưng theo minh thời gian như vậy thì không thành vấn đề).
1. Bạn dùng wet blot hay semi-dry?
2. Bạn nên luôn cho ladder vào vì bằng cách đó bạn có thể nhận định nhanh xem là protein còn trên gel? đã lên màng? hoặc đã xuyên qua màng?. Nếu bạn chưa từng làm với điều kiện transfer đấy lần nào thì sau khi transfer thì đem acrylamide gel đi nhuộm xem còn protein không? Nếu sợ thời gian ủ qua lâu thì đặt 2 membrane cạnh nhau và sau này kiểm tra cả 2 membrane xem membrane thứ 1 có bị xuyên qua hay không?
3. Luôn cần cho positive control vào để biết Ab hoạt động bt hay không? Bạn nhuộm màu bằng kit gì? Tối ưu chưa? Thời gian exposure đúng k? Có thể nếu dùng chemiluminescence mà không thấy signal thì dùng thử các cách nhuộm colorimetric detection để kiểm tra sai sót nằm ở khâu nào.
http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=5A3F09D2-5056-8A76-4E96-30DFE2E1B731
2. Bạn nên luôn cho ladder vào vì bằng cách đó bạn có thể nhận định nhanh xem là protein còn trên gel? đã lên màng? hoặc đã xuyên qua màng?. Nếu bạn chưa từng làm với điều kiện transfer đấy lần nào thì sau khi transfer thì đem acrylamide gel đi nhuộm xem còn protein không? Nếu sợ thời gian ủ qua lâu thì đặt 2 membrane cạnh nhau và sau này kiểm tra cả 2 membrane xem membrane thứ 1 có bị xuyên qua hay không?
3. Luôn cần cho positive control vào để biết Ab hoạt động bt hay không? Bạn nhuộm màu bằng kit gì? Tối ưu chưa? Thời gian exposure đúng k? Có thể nếu dùng chemiluminescence mà không thấy signal thì dùng thử các cách nhuộm colorimetric detection để kiểm tra sai sót nằm ở khâu nào.
http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=5A3F09D2-5056-8A76-4E96-30DFE2E1B731
paltin
Senior Member
Thank Hiếu nhiều,
Mình dùng wet blot và xác định protein trên màng theo protocol này
Tôi biết Ponceus, nó nhuộm nhanh nhưng yếu. Sau khi nhuộm xong bạn có chụp ảnh lại không? Bạn có thấy nó ít hơn hoặc nhiều hơn so với những lần chuyển màng khác?
Đk mình thường chạy khi wet transfer (dùng bộ Western blot của Biorad) là:
+ 1h ở 250mA (hằng) trong đk có icepack + ice bọc ngoài tank (đựng trong hộp xốp)
+ 3h ở 130 mA (hằng) trong đk có icepack không cần ice bọc ngoài tank
Nhìn chung thì gel nồng độ cao transfer khó hơn gel nồng độ thấp và protein trọng lượng phân tử cao transfer khó hơn protein trọng lượng phân tử thấp.
Về độ ổn định thì mình thấy hình như thời gian cho kháng thể 1 vào không nên để overnight mà nên khoảng 2-4 tiếng thì ổn định hơn. Mình dạo này hay để kháng thể 1 overnight và kết quả thường rất không ổn định. KHông biết đó có phải là lý do không.
+ 1h ở 250mA (hằng) trong đk có icepack + ice bọc ngoài tank (đựng trong hộp xốp)
+ 3h ở 130 mA (hằng) trong đk có icepack không cần ice bọc ngoài tank
Nhìn chung thì gel nồng độ cao transfer khó hơn gel nồng độ thấp và protein trọng lượng phân tử cao transfer khó hơn protein trọng lượng phân tử thấp.
Về độ ổn định thì mình thấy hình như thời gian cho kháng thể 1 vào không nên để overnight mà nên khoảng 2-4 tiếng thì ổn định hơn. Mình dạo này hay để kháng thể 1 overnight và kết quả thường rất không ổn định. KHông biết đó có phải là lý do không.
Bạn dùng 3 antibody thì phải dùng 3 twin gel để chuyển lên 3 màng. Chưa bao giờ thử cho 2 kháng thể sơ cấp vào cùng 1 lúc nhưng nói chung là người ta không khuyến khích làm như vậy.
Không hiểu tại sao bạn lại không cho prestained ladder vào. Thời buổi này prestained ladder thường được dùng rất phổ biến và không cần phải nhuộm Ponceau nữa. Chạy biết ngay transfer có tốt hay không liền à.
Không hiểu tại sao bạn lại không cho prestained ladder vào. Thời buổi này prestained ladder thường được dùng rất phổ biến và không cần phải nhuộm Ponceau nữa. Chạy biết ngay transfer có tốt hay không liền à.
bổ sung tí chút. Nếu cố định dòng thì cường độ dòng phụ thuộc vào độ dày của gel hay chính là độ dày của spacer mà bạn dùng để đúc gel.
Phạm Đình Chương
Senior Member
Mình đưa thông số Western mình thường chạy để bạn tham khảo (kit Biorad):
- Sau khi chạy SDS-PAGE (50V sau khi ra running gel thì tăng 100V sẽ cho band đẹp), transfer.
- Chạy 1h30 tới 2h, 250 mA. Thường mình check mẫu 30 kDa đến 150 kDa đều ổn với thông số này.
* Có một điều lưu ý là cách chuyển gel qua Western set phải đúng. Thường 1 set gồm có: giá đựng, giá kẹp, 2 sponge, 2 giấy 3M, màng PVDF (activate với Methanol trước) hay NC (không cần activate với Methanol). Giá kẹp của Biorad có 2 màu: ĐEN và TRẮNG. Mình sẽ xếp mẫu trên bề mặt đen như sau: Sponge, 3M, gel (nếu marker lúc chạy gel load bên phải thì lúc này phải chuyển sang trái), màng, 3M, sponge. Đóng lại. Giá đựng cũng có 2 màu: ĐEN và ĐỎ. Đặt giá kẹp bề màu đen về hướng màu đen của giá đựng. Gắn đúng điện cực ĐỎ và ĐEN. Bấm Run. Để ý coi có sủi bọt hay không để xem nguồn điện có hoạt động?
- Sau 90-120 phút, lấy màng ra blocking 1h-2h.
- Ủ 1st Ab overnight, 4 độ C. Rửa PBST.
- Ủ 2nd Ab, 1h, 4 độ C. Rửa PBST. Chú ý gắn AP hay HRP (thông dụng) thì cách phát hiện band cũng khác nhau.
* Không nên ủ 1 lần với nhiều Ab. Nên có marker.
- Sau khi chạy SDS-PAGE (50V sau khi ra running gel thì tăng 100V sẽ cho band đẹp), transfer.
- Chạy 1h30 tới 2h, 250 mA. Thường mình check mẫu 30 kDa đến 150 kDa đều ổn với thông số này.
* Có một điều lưu ý là cách chuyển gel qua Western set phải đúng. Thường 1 set gồm có: giá đựng, giá kẹp, 2 sponge, 2 giấy 3M, màng PVDF (activate với Methanol trước) hay NC (không cần activate với Methanol). Giá kẹp của Biorad có 2 màu: ĐEN và TRẮNG. Mình sẽ xếp mẫu trên bề mặt đen như sau: Sponge, 3M, gel (nếu marker lúc chạy gel load bên phải thì lúc này phải chuyển sang trái), màng, 3M, sponge. Đóng lại. Giá đựng cũng có 2 màu: ĐEN và ĐỎ. Đặt giá kẹp bề màu đen về hướng màu đen của giá đựng. Gắn đúng điện cực ĐỎ và ĐEN. Bấm Run. Để ý coi có sủi bọt hay không để xem nguồn điện có hoạt động?
- Sau 90-120 phút, lấy màng ra blocking 1h-2h.
- Ủ 1st Ab overnight, 4 độ C. Rửa PBST.
- Ủ 2nd Ab, 1h, 4 độ C. Rửa PBST. Chú ý gắn AP hay HRP (thông dụng) thì cách phát hiện band cũng khác nhau.
* Không nên ủ 1 lần với nhiều Ab. Nên có marker.
