paltin
Senior Member
Mình thấy nó giảm so với các lần, khi chụp thì mờ hơn!Tôi biết Ponceus, nó nhuộm nhanh nhưng yếu. Sau khi nhuộm xong bạn có chụp ảnh lại không? Bạn có thấy nó ít hơn hoặc nhiều hơn so với những lần chuyển màng khác?
Follow along with the video below to see how to install our site as a web app on your home screen.
Note: This feature may not be available in some browsers.
Mình thấy nó giảm so với các lần, khi chụp thì mờ hơn!Tôi biết Ponceus, nó nhuộm nhanh nhưng yếu. Sau khi nhuộm xong bạn có chụp ảnh lại không? Bạn có thấy nó ít hơn hoặc nhiều hơn so với những lần chuyển màng khác?
Theo mình thì để overnight 4 độ C khi ủ với skim milk thì tốt, Chứ khi cho kháng thể 1 vào rồi để overnight thì màng chụp lên không rõ, cái này mình đã thử (một lần chạy 2 gel 10% cùng lượng Protein cùng thời gian chuyển màng... chỉ khác là 1 gel mình để với sữa qua đêm, một gel mình để với kháng thể 1 qua đêm thì khi chụp thấy gel để sữa qua đêm rõ hơn ). không biết có bạn nào kiểm chứng chưa xin xho ý kiếnĐk mình thường chạy khi wet transfer (dùng bộ Western blot của Biorad) là:
+ 1h ở 250mA (hằng) trong đk có icepack + ice bọc ngoài tank (đựng trong hộp xốp)
+ 3h ở 130 mA (hằng) trong đk có icepack không cần ice bọc ngoài tank
Nhìn chung thì gel nồng độ cao transfer khó hơn gel nồng độ thấp và protein trọng lượng phân tử cao transfer khó hơn protein trọng lượng phân tử thấp.
Về độ ổn định thì mình thấy hình như thời gian cho kháng thể 1 vào không nên để overnight mà nên khoảng 2-4 tiếng thì ổn định hơn. Mình dạo này hay để kháng thể 1 overnight và kết quả thường rất không ổn định. KHông biết đó có phải là lý do không.
Đúng là cho 3 kháng thể cùng lúc sẽ không tốt, đồng thời kkhi dùng lại tín hiệu có lẽ sẽ giảm (thông thường thấy mọi người nói khi cho 1 kháng thể vào có thể dùng lại 2-3 lần còn khi cho nhiều kháng thể sẽ không dùng được lâu). Cái này mình chỉ nghe nói thôi chứ không chắc. (khi cho nhiều kháng thể chúng có tác động và ảnh hường gì tới nhau không?)Bạn dùng 3 antibody thì phải dùng 3 twin gel để chuyển lên 3 màng. Chưa bao giờ thử cho 2 kháng thể sơ cấp vào cùng 1 lúc nhưng nói chung là người ta không khuyến khích làm như vậy.
Không hiểu tại sao bạn lại không cho prestained ladder vào. Thời buổi này prestained ladder thường được dùng rất phổ biến và không cần phải nhuộm Ponceau nữa. Chạy biết ngay transfer có tốt hay không liền à.
Xin hỏi bạn đã thử khi để 4 độ với để nhiệt độ phòng cái nào tốt hơn cho việc gắn kháng thể, và tín hiệu cái nào tốt hơnMình đưa thông số Western mình thường chạy để bạn tham khảo (kit Biorad):
- Sau khi chạy SDS-PAGE (50V sau khi ra running gel thì tăng 100V sẽ cho band đẹp), transfer.
- Chạy 1h30 tới 2h, 250 mA. Thường mình check mẫu 30 kDa đến 150 kDa đều ổn với thông số này.
* Có một điều lưu ý là cách chuyển gel qua Western set phải đúng. Thường 1 set gồm có: giá đựng, giá kẹp, 2 sponge, 2 giấy 3M, màng PVDF (activate với Methanol trước) hay NC (không cần activate với Methanol). Giá kẹp của Biorad có 2 màu: ĐEN và TRẮNG. Mình sẽ xếp mẫu trên bề mặt đen như sau: Sponge, 3M, gel (nếu marker lúc chạy gel load bên phải thì lúc này phải chuyển sang trái), màng, 3M, sponge. Đóng lại. Giá đựng cũng có 2 màu: ĐEN và ĐỎ. Đặt giá kẹp bề màu đen về hướng màu đen của giá đựng. Gắn đúng điện cực ĐỎ và ĐEN. Bấm Run. Để ý coi có sủi bọt hay không để xem nguồn điện có hoạt động?
- Sau 90-120 phút, lấy màng ra blocking 1h-2h.
- Ủ 1st Ab overnight, 4 độ C. Rửa PBST.
- Ủ 2nd Ab, 1h, 4 độ C. Rửa PBST. Chú ý gắn AP hay HRP (thông dụng) thì cách phát hiện band cũng khác nhau.
* Không nên ủ 1 lần với nhiều Ab. Nên có marker.
Xin hỏi bạn đã thử khi để 4 độ với để nhiệt độ phòng cái nào tốt hơn cho việc gắn kháng thể, và tín hiệu cái nào tốt hơn
Thanks
Thanhk bạn nhiều,Đối với 1st antibody, để 4 độ C và overnight là tốt nhất; 2nd antibody thì do chỉ ủ 1h nên bạn có thể để ở RT hay 4 độ C đều được. Dù sao mình thích ủ 4 độ C hơn (do lab mình có phòng lạnh và shaker).
Thanhk bạn nhiều,
À cho mình hỏi thêm thông thường mỗi giếng (well) hàm lượng protein là ? mg và tổng thể tích (mẫu và SDS buffer) là bao nhiêu là hợp lý.
Tỷ lệ protein và SDS buffer 5X là 1:4 là được chứ.
Cảm ơn bạn nhiều,- Tùy mẫu bạn load. Nếu là protein tinh sạch, load 5 ug là vừa. Nếu bạn load cell lysate, có thể kiểm tra bằng Bradford assay. Thường mình nhìn vào pellet rồi đoán lượng SDS buffer (do có kiểm chứng bằng beta actin).
- Tổng thể tích cho 1 giếng tùy thuộc comb bạn dùng. Nếu 1.5 mm thì load 40-45 ul là tối đa.
- Bạn có thể dùng 2X SDS buffer nếu kiểm tra cell pellet. Nếu protein trong PBS chẳng hạn thì nên dùng 5X SDS buffer để hạn chế pha loãng.
Cách này của bác hay thật đấy (cho sample rồi run 5min rồi load tiếp) có dịp sẽ thử. nếu như vậy mình nghĩ phần run stacking gel cho chỉ số V giảm đi chắc là OK???Muốn load nhiều không khó. Bạn xài loading buffer có glycerol cao lên một chút so với công thức (thành phần glycerol vẫn thường thay đổi ở các công thức trong loading buffer). Mình không load 65 ul mà load 35 ul cho spacer 1mm. Bạn mình load 65 ul cho spacer 1.5ml. Với spacer 1.5mm cái yellow pipette có thể đút gọn vào giếng chứ không nằm trên miệng giếng. Nguyên tắc load nhiều là vậy: load chậm và dùng pipette đủ nhỏ (để đút được vào spacer) và đẩy nhẹ vào giếng.
Thật ra load nhiều là một việc làm bất đắc dĩ (chứ không phải cái đem đi khoe). Trường hợp plant là vì nồng độ protein chỉ khoảng từ 1-2 ug/ul và bạn mình phải detect denatured protein bằng ab against native protein (nên lượng target protein cần lên tới vài trăm ng). Trường hợp của mình phải load 35ul vì protein là culture filtrate của nấm men và muốn nhuộm Coomassie blue thay vì nhuộm bạc.
Những người làm PAGE lâu năm vẫn có nhiều mẹo để load nhiều mẫu lên 1 giếng:
+ cô đặc bằng Acetone (nếu nồng độ muối không đáng kể)
+ để gel chạy khoảng 3-5 phút (sample vẫn trong stacking) rồi load thêm lên giếng.
Cái này phải hỏi A Luong và A Chuong thôi ^_^em chào các anh, hiện tại em đang làm 1 đề tài về kháng thể động vật, các anh có thể cho em hỏi nhiệt độ và thời gian bảo quản ảnh hưởng như thế nào tới cấu trúc và chức năng của kháng thể không ah?
Em xin rất, rất chân thành cảm ơn!
Tuy nhiên trường hợp antiserum không đặc hiệu cao thì dấu hiệu mất hoạt tính của kháng thể rõ hơn nhiều. Ví dụ 1 lần làm polyclonal antibody cho 1 protein khoảng 80 kDa. Không tinh sạch bằng cột được nên elution từ...gel và tiêm vào chuột. Kết quả antiserum rất yếu và khi cất 1 năm ở -80 thì mất hẳn hoạt tính
Bảo quản antibody thì đúng là có nhiều cách tùy tính chất của nó. Thường bên mình thu antiserum xong chia nhỏ rồi trữ -70 độ C, mấy năm nay vẫn "chạy" tốt. Lấy ra dùng thì lại chia nhỏ nữa để -20 độ C. Làm xong để lại -20 độ C khoảng 1 tháng vẫn còn tốt.