paltin
Senior Member
Mình thấy nó giảm so với các lần, khi chụp thì mờ hơn!
Tác dụng của skim milk trong western blot?
- Thread starter paltin
- Start date
paltin
Senior Member
Theo mình thì để overnight 4 độ C khi ủ với skim milk thì tốt, Chứ khi cho kháng thể 1 vào rồi để overnight thì màng chụp lên không rõ, cái này mình đã thử (một lần chạy 2 gel 10% cùng lượng Protein cùng thời gian chuyển màng... chỉ khác là 1 gel mình để với sữa qua đêm, một gel mình để với kháng thể 1 qua đêm thì khi chụp thấy gel để sữa qua đêm rõ hơn ). không biết có bạn nào kiểm chứng chưa xin xho ý kiến
Tại mới chỉ thực hiện 1 lần nên chưa dám khẳng định?
paltin
Senior Member
Đúng là cho 3 kháng thể cùng lúc sẽ không tốt, đồng thời kkhi dùng lại tín hiệu có lẽ sẽ giảm (thông thường thấy mọi người nói khi cho 1 kháng thể vào có thể dùng lại 2-3 lần còn khi cho nhiều kháng thể sẽ không dùng được lâu). Cái này mình chỉ nghe nói thôi chứ không chắc. (khi cho nhiều kháng thể chúng có tác động và ảnh hường gì tới nhau không?)
paltin
Senior Member
Xin hỏi bạn đã thử khi để 4 độ với để nhiệt độ phòng cái nào tốt hơn cho việc gắn kháng thể, và tín hiệu cái nào tốt hơn
Thanks
Phạm Đình Chương
Senior Member
Đối với 1st antibody, để 4 độ C và overnight là tốt nhất; 2nd antibody thì do chỉ ủ 1h nên bạn có thể để ở RT hay 4 độ C đều được. Dù sao mình thích ủ 4 độ C hơn (do lab mình có phòng lạnh và shaker).
paltin
Senior Member
Thanhk bạn nhiều,
À cho mình hỏi thêm thông thường mỗi giếng (well) hàm lượng protein là ? mg và tổng thể tích (mẫu và SDS buffer) là bao nhiêu là hợp lý.
Tỷ lệ protein và SDS buffer 5X là 1:4 là được chứ.
Phạm Đình Chương
Senior Member
- Tùy mẫu bạn load. Nếu là protein tinh sạch, load 5 ug là vừa. Nếu bạn load cell lysate, có thể kiểm tra bằng Bradford assay. Thường mình nhìn vào pellet rồi đoán lượng SDS buffer (do có kiểm chứng bằng beta actin).
- Tổng thể tích cho 1 giếng tùy thuộc comb bạn dùng. Nếu 1.5 mm thì load 40-45 ul là tối đa.
- Bạn có thể dùng 2X SDS buffer nếu kiểm tra cell pellet. Nếu protein trong PBS chẳng hạn thì nên dùng 5X SDS buffer để hạn chế pha loãng.
paltin
Senior Member
Cảm ơn bạn nhiều,
Xin hỏi bạn này đang làm về đề tài và lĩnh vực gì? có thể cho minh xin địa chỉ mail được không, cho dễ liên lạc. Mail cua mình: vantinh_dhqg@yahoo.com
Hic, làm cả trăm cái PAGE rồi mà mỗi lần nói chuyện với GS vẫn bị thắc mắc cái vụ làm sao mày load được 35 ul protein/giếng cho spacer 1mm. Nếu có cái Hamilton syringe thì càng dễ (nhưng mất thời gian) còn không enzyme pipette cũng làm được điều đó. Với spacer 1.5 bạn mình load 65 ul (total plant protein) bằng yellow pipette tip. Mình làm Yeast thì nói chung trên 80 ug là khó nhìn ra từng băng rồi (nhưng cần Western đẹp nên phải xài hơi nhiều protein tí). Nếu là protein tinh sạch bạn nên load tầm 0.2-0.5 ug là đủ rồi (load nhiều sẽ hiện băng tạp trên ảnh).
Phạm Đình Chương
Senior Member
@Paltin: email của mình là dumucc@yahoo.com. Mong được làm quen với bạn.
@Bác Lương: Không biết trình độ bác Lương giỏi hay bác nói quá chứ lab tôi load 50 ul cho spacer 1.5 mm còn được, quá là tràn ra ngay. Mong có dịp sẽ được học hỏi bác.
@Bác Lương: Không biết trình độ bác Lương giỏi hay bác nói quá chứ lab tôi load 50 ul cho spacer 1.5 mm còn được, quá là tràn ra ngay. Mong có dịp sẽ được học hỏi bác.
Muốn load nhiều không khó. Bạn xài loading buffer có glycerol cao lên một chút so với công thức (thành phần glycerol vẫn thường thay đổi ở các công thức trong loading buffer). Mình không load 65 ul mà load 35 ul cho spacer 1mm. Bạn mình load 65 ul cho spacer 1.5ml. Với spacer 1.5mm cái yellow pipette có thể đút gọn vào giếng chứ không nằm trên miệng giếng. Nguyên tắc load nhiều là vậy: load chậm và dùng pipette đủ nhỏ (để đút được vào spacer) và đẩy nhẹ vào giếng.
Thật ra load nhiều là một việc làm bất đắc dĩ (chứ không phải cái đem đi khoe). Trường hợp plant là vì nồng độ protein chỉ khoảng từ 1-2 ug/ul và bạn mình phải detect denatured protein bằng ab against native protein (nên lượng target protein cần lên tới vài trăm ng). Trường hợp của mình phải load 35ul vì protein là culture filtrate của nấm men và muốn nhuộm Coomassie blue thay vì nhuộm bạc.
Những người làm PAGE lâu năm vẫn có nhiều mẹo để load nhiều mẫu lên 1 giếng:
+ cô đặc bằng Acetone (nếu nồng độ muối không đáng kể)
+ để gel chạy khoảng 3-5 phút (sample vẫn trong stacking) rồi load thêm lên giếng.
Thật ra load nhiều là một việc làm bất đắc dĩ (chứ không phải cái đem đi khoe). Trường hợp plant là vì nồng độ protein chỉ khoảng từ 1-2 ug/ul và bạn mình phải detect denatured protein bằng ab against native protein (nên lượng target protein cần lên tới vài trăm ng). Trường hợp của mình phải load 35ul vì protein là culture filtrate của nấm men và muốn nhuộm Coomassie blue thay vì nhuộm bạc.
Những người làm PAGE lâu năm vẫn có nhiều mẹo để load nhiều mẫu lên 1 giếng:
+ cô đặc bằng Acetone (nếu nồng độ muối không đáng kể)
+ để gel chạy khoảng 3-5 phút (sample vẫn trong stacking) rồi load thêm lên giếng.
paltin
Senior Member
Cách này của bác hay thật đấy (cho sample rồi run 5min rồi load tiếp) có dịp sẽ thử. nếu như vậy mình nghĩ phần run stacking gel cho chỉ số V giảm đi chắc là OK???
Không biết mọi người nghĩ sao?
Tiện thể cho em hỏi tại sao lại dùng b-actin làm control nhỉ? (mới vào nghề chưa biết mong bác chỉ giáo nhiều)
Thanks
Nguyễn Thanh Hiên
Senior Member
em chào các anh, hiện tại em đang làm 1 đề tài về kháng thể động vật, các anh có thể cho em hỏi nhiệt độ và thời gian bảo quản ảnh hưởng như thế nào tới cấu trúc và chức năng của kháng thể không ah?
Em xin rất, rất chân thành cảm ơn!
Em xin rất, rất chân thành cảm ơn!
paltin
Senior Member
Cái này phải hỏi A Luong và A Chuong thôi ^_^
Mình làm polyclonal antibody cho proteins của mình xong sau khi thu hoạch antiserum thì chia lô nhỏ khoảng 20-30 ul/ống 1.5ml và để ở -20 C cả năm trời không hề hấn gì. Nếu cẩn thận hơn thì pha thêm sodium azide để kháng khuẩn là được. Khi dùng thì lấy 1 ống để ở 4 độ C cả vài tháng trời cũng không sao.
Tuy nhiên trường hợp antiserum không đặc hiệu cao thì dấu hiệu mất hoạt tính của kháng thể rõ hơn nhiều. Ví dụ 1 lần làm polyclonal antibody cho 1 protein khoảng 80 kDa. Không tinh sạch bằng cột được nên elution từ...gel và tiêm vào chuột. Kết quả antiserum rất yếu và khi cất 1 năm ở -80 thì mất hẳn hoạt tính
Tuy nhiên trường hợp antiserum không đặc hiệu cao thì dấu hiệu mất hoạt tính của kháng thể rõ hơn nhiều. Ví dụ 1 lần làm polyclonal antibody cho 1 protein khoảng 80 kDa. Không tinh sạch bằng cột được nên elution từ...gel và tiêm vào chuột. Kết quả antiserum rất yếu và khi cất 1 năm ở -80 thì mất hẳn hoạt tính
Tuy nhiên trường hợp antiserum không đặc hiệu cao thì dấu hiệu mất hoạt tính của kháng thể rõ hơn nhiều. Ví dụ 1 lần làm polyclonal antibody cho 1 protein khoảng 80 kDa. Không tinh sạch bằng cột được nên elution từ...gel và tiêm vào chuột. Kết quả antiserum rất yếu và khi cất 1 năm ở -80 thì mất hẳn hoạt tính
Trường hợp này có thể tinh sạch antiserum bằng antigen của nó.
Phạm Đình Chương
Senior Member
Bảo quản antibody thì đúng là có nhiều cách tùy tính chất của nó. Thường bên mình thu antiserum xong chia nhỏ rồi trữ -70 độ C, mấy năm nay vẫn "chạy" tốt. Lấy ra dùng thì lại chia nhỏ nữa để -20 độ C. Làm xong để lại -20 độ C khoảng 1 tháng vẫn còn tốt.
tôi cho rằng việc làm tan liên tục antiserum sẽ làm hỏng nó nhanh hơn. Thông thường, nhóm tôi vẫn để 4oC sau khi lấy ra từ -70oC. (như cách của lab a Lương).
Phạm Đình Chương
Senior Member
Tôi ko nói là mình làm mẫu liên tục. Nếu làm liên tục thì để ở 4 độ C là đúng.
