Follow along with the video below to see how to install our site as a web app on your home screen.
Note: This feature may not be available in some browsers.
-Thật ra nói skim milk rẻ hơn nên được ưa chuộng hơn thì không chính xác. Có nhiều kháng thể phù hợp với BSA hơn là skim milk nên dù mắc mình cũng phải dùng BSA. Khi bạn dùng skim milk cho kết quả không đẹp thì nên chuyển sang BSA để so sánh ngay.
-Thời gian cho blocking thường khoảng 1h-2h, RT hay 4 độ C đều được. Nếu bạn cảm thấy kháng thể cho background xấu thì có thể tăng thời gian blocking lên hay washing kỹ hơn.
Khi chuyển màng mình để điều trong dieu kiện lạnhBạn tiến hành chuyển màng với những điều kiện như thế nào và kích thước protein của bạn mong đợi là bao nhiêu KDa, marker trên màng thế nào?
Thời gian 1h30p 100V, 500mAThời gian và hiệu điện thế bạn dùng trong chuyển màng là bao nhiêu. Mình nghĩ không nên dùng cùng lúc 3 kháng thể vì đến lúc có band sẽ không biết là có đặc hiệu hay không, band do kháng thể nào mà ra.
Thế bạn cố định dòng hay hiệu điện thế vậy, bạn chỉ đặt được một trong hai thông số thôi mà. Màng của bạn đã ngâm trong sữa, ủ với kháng thể thì đương nhiên phải có protein rồi (phải không nhỉ). Có vẻ thời gian bạn chuyển màng hơi lâu và dòng hơi cao. Bạn có thể làm chuyển màng ở 350 mA và thời gian chuyển màng 90 phút cho protein 90 KDa, còn 45 phút cho protein 40 KDa không?Thời gian 1h30p 100V, 500mA
Đúng là lần trước mình cói coi người bạn làm cho nhiều kháng thể vào band không rõ.
Mình có dùng ponceau red để nhuộm màng thì thấy có protein. Do đó không biết có phải do Primary anti hay Second anti hay không nữa?
Thank
Thank nhiều,Thế bạn cố định dòng hay hiệu điện thế vậy, bạn chỉ đặt được một trong hai thông số thôi mà. Màng của bạn đã ngâm trong sữa, ủ với kháng thể thì đương nhiên phải có protein rồi (phải không nhỉ). Có vẻ thời gian bạn chuyển màng hơi lâu và dòng hơi cao. Bạn có thể làm chuyển màng ở 350 mA và thời gian chuyển màng 90 phút cho protein 90 KDa, còn 45 phút cho protein 40 KDa không?
Thank Hiếu nhiều,1. Bạn dùng wet blot hay semi-dry?
2. Bạn nên luôn cho ladder vào vì bằng cách đó bạn có thể nhận định nhanh xem là protein còn trên gel? đã lên màng? hoặc đã xuyên qua màng?. Nếu bạn chưa từng làm với điều kiện transfer đấy lần nào thì sau khi transfer thì đem acrylamide gel đi nhuộm xem còn protein không? Nếu sợ thời gian ủ qua lâu thì đặt 2 membrane cạnh nhau và sau này kiểm tra cả 2 membrane xem membrane thứ 1 có bị xuyên qua hay không?
3. Luôn cần cho positive control vào để biết Ab hoạt động bt hay không? Bạn nhuộm màu bằng kit gì? Tối ưu chưa? Thời gian exposure đúng k? Có thể nếu dùng chemiluminescence mà không thấy signal thì dùng thử các cách nhuộm colorimetric detection để kiểm tra sai sót nằm ở khâu nào.
Thank Hiếu nhiều,
Mình dùng wet blot và xác định protein trên màng theo protocol này
Đk mình thường chạy khi wet transfer (dùng bộ Western blot của Biorad) là:
+ 1h ở 250mA (hằng) trong đk có icepack + ice bọc ngoài tank (đựng trong hộp xốp)
+ 3h ở 130 mA (hằng) trong đk có icepack không cần ice bọc ngoài tank
Nhìn chung thì gel nồng độ cao transfer khó hơn gel nồng độ thấp và protein trọng lượng phân tử cao transfer khó hơn protein trọng lượng phân tử thấp.
Về độ ổn định thì mình thấy hình như thời gian cho kháng thể 1 vào không nên để overnight mà nên khoảng 2-4 tiếng thì ổn định hơn. Mình dạo này hay để kháng thể 1 overnight và kết quả thường rất không ổn định. KHông biết đó có phải là lý do không.