Vũ Thị Hoàn
Senior Member
Xin chào cả nhà
Cả nhà có ai từng làm DNA-DNA hybridization rồi thì cho mình xin ít kinh nghiệm với.
Cả nhà có ai từng làm DNA-DNA hybridization rồi thì cho mình xin ít kinh nghiệm với.
DNA-DNA hybridization
- Thread starter Vũ Thị Hoàn
- Start date
Ý bạn là Southern và colony hybridization?
Mình thấy không có khó khăn gì cả. Có điều mình làm phóng xạ. Chắc chỗ bạn làm DIG-labeled probes.
Bạn có khó khăn cứ gửi lên diễn đàn.
Mình thấy không có khó khăn gì cả. Có điều mình làm phóng xạ. Chắc chỗ bạn làm DIG-labeled probes.
Bạn có khó khăn cứ gửi lên diễn đàn.
Vũ Thị Hoàn
Senior Member
Cám ơn Lương nhé,
Mình làm về:
DNA-DNA hybridization carry out with closely related species (>97% sequence similarities) to determine the novel species using photobiotin-labelled probes.
Vấn đề của mình ở chỗ là enzyme không active nên không cho kết quả, mình không biết liệu có phải do lượng enzyme sử dụng ít hay trong quá trình lai có vấn đề. GS và những người từng làm về vấn đề này đều nói khó và họ không chỉ ra khó ở khâu nào. Mình tự mày mò, điều chỉnh mấy lần rồi mà vẫn không thành công. Time cho TN này của mình còn rất ít vì GS phụ trách lab chuyên làm về taxonomic chuẩn bị về hưu nên toàn bộ thiết bị sẽ chuyển đi nơi khác. Mình không chuyên về taxonomic, chỉ là do trong quá trình nghiên cứu mình tìm được vài loài VK nghi là loài mới nên phải làm thôi. Nếu Lương hay các bạn khác có kinh nghiệm về việc này thì cho mình biết nguyên nhân thất bại của mình với.
Mình làm về:
DNA-DNA hybridization carry out with closely related species (>97% sequence similarities) to determine the novel species using photobiotin-labelled probes.
Vấn đề của mình ở chỗ là enzyme không active nên không cho kết quả, mình không biết liệu có phải do lượng enzyme sử dụng ít hay trong quá trình lai có vấn đề. GS và những người từng làm về vấn đề này đều nói khó và họ không chỉ ra khó ở khâu nào. Mình tự mày mò, điều chỉnh mấy lần rồi mà vẫn không thành công. Time cho TN này của mình còn rất ít vì GS phụ trách lab chuyên làm về taxonomic chuẩn bị về hưu nên toàn bộ thiết bị sẽ chuyển đi nơi khác. Mình không chuyên về taxonomic, chỉ là do trong quá trình nghiên cứu mình tìm được vài loài VK nghi là loài mới nên phải làm thôi. Nếu Lương hay các bạn khác có kinh nghiệm về việc này thì cho mình biết nguyên nhân thất bại của mình với.
Em đã từng làm thất bại hybridization vì lượng mồi quá ít. Protocol của lab cứ bảo là chỉ dùng 20ng DNA. Nhưng probe nhỏ (<400 bp) thì khi elution rất dễ mất mát. Chính vì vậy em dùng tới 10 ul/50 ul PCR reaction để làm probe và cho kết quả mỹ mãn.
Về vấn đề của chị thì 97% chắc là đủ để lai tốt rồi. Không biết chiều dài probe là bao nhiêu. Phương pháp làm probe là gì (bên em làm random primer extension). Chị có thể loại suy bằng phương pháp sau:
1. Cho PC (là template để làm probe) vào mẫu để kiểm tra vấn đề lai. Nếu có băng thì chứng tỏ chị phải xem lại mẫu genomic DNA, xem digestion có ổn không, lượng mẫu có đủ không.
2. Giảm nhiệt độ lai nếu cảm thấy homology chưa đủ
3. Chị có thể kiểm tra riêng chất lượng enzyme bằng cách chỉ kiểm tra sự đổi màu trong dung dịch mà.
Về vấn đề của chị thì 97% chắc là đủ để lai tốt rồi. Không biết chiều dài probe là bao nhiêu. Phương pháp làm probe là gì (bên em làm random primer extension). Chị có thể loại suy bằng phương pháp sau:
1. Cho PC (là template để làm probe) vào mẫu để kiểm tra vấn đề lai. Nếu có băng thì chứng tỏ chị phải xem lại mẫu genomic DNA, xem digestion có ổn không, lượng mẫu có đủ không.
2. Giảm nhiệt độ lai nếu cảm thấy homology chưa đủ
3. Chị có thể kiểm tra riêng chất lượng enzyme bằng cách chỉ kiểm tra sự đổi màu trong dung dịch mà.
Vũ Thị Hoàn
Senior Member
Sau khi chiết xuất DNA những DNA purity ở mức 260/280 >1.80 và đử lượng, mình dùng trực tiếp để lai. Nhiệt độ lai mình dùng 55 độ và tỷ lệ C+G của DNA khoảng 65% mol, lượng DNA của DNA refference là 10ug/ml dùng 100ul cho mỗi well. DNA probe là 1mg/ml dùng 10ul mix với 10ul photobiotin solution, lai cho 9 well, final concentration khoảng gần 1ug/ well (nếu không thất thoát khi rửa loại photobiotin thừa), theo protocol chỉ cần 150ng/well.
Mình cũng vừa kiểm tra enzyme và không thấy đổi màu. Emzyme mới toanh, không biết có phải tại substrate không nên mình đang định chuẩn bị lại substrate.
Mình dùng enzyme Streptavidin neta D galactosidase và substrate là 4-Methylumbelliferyl beta D galactopyranoside.
Lương có là theo protocol của Ezaki et al 1989 không? Đây là protocol mình làm theo.
Mình cũng vừa kiểm tra enzyme và không thấy đổi màu. Emzyme mới toanh, không biết có phải tại substrate không nên mình đang định chuẩn bị lại substrate.
Mình dùng enzyme Streptavidin neta D galactosidase và substrate là 4-Methylumbelliferyl beta D galactopyranoside.
Lương có là theo protocol của Ezaki et al 1989 không? Đây là protocol mình làm theo.
Dạ em không. Em làm theo protocol của lab. Xem ra chị xem lại cái substrate enzyme reaction rồi.
Riêng chuyện lai không ra thì cũng có trường hợp đó. Nhớ không nhầm thì hồi xưa có bài báo trên diễn đàn về Paul Nurse làm mấy cái gene Cdc ở người dùng probe của nấm men mãi cũng không ra đấy.
Riêng chuyện lai không ra thì cũng có trường hợp đó. Nhớ không nhầm thì hồi xưa có bài báo trên diễn đàn về Paul Nurse làm mấy cái gene Cdc ở người dùng probe của nấm men mãi cũng không ra đấy.
Ho Huu Tho
Senior Member
Trước khi làm những thí nghiệm lai thế này thì có cần phải kiểm tra cấu trúc bậc hai của trình tự dùng để lai không ạ?
Không biết protocol khác thế nào chứ protocol lab mình thì không cần. Sau khi đun 100% 10 phút và làm lạnh nhanh trong đá >2 phút, rồi cho vào lai ở 65 độ C thì đảm bảo lai tốt. Có thể các nhiệt độ này, và sự thay đổi nhiệt độ đột ngột như vậy làm cho cấu trúc bậc 2 khó tạo thành.
Vũ Thị Hoàn
Senior Member
Protocol cua minh cung khong quan tam den cau truc bac 2 cua trinh tu lai. Minh van dang lam va chua thay co dau hieu thanh cong, do chua tim hieu duoc nguyen nhan tai sao enzyme lai khong active. Khi nao co ket qua, minh se bao cao voi moi nguoi.
Ho Huu Tho
Senior Member
Liệu có khả năng do cấu trúc bậc hai gây cản trở đến quá trình lai không chị? Chị thử phân tích cấu trúc bậc hai của probe xem thế nào.
Vũ Thị Hoàn
Senior Member
Van de cua minh la enzyme khong active, minh dang test enzyme voi mot vai substrate khac nhau, sau khi biet chac chan enzyme hoat dong tot, roi xem ket qua lai the nao moi xac dinh duoc nguyen nhan tai sao.
Ho Huu Tho
Senior Member
Anh Lương cho em hỏi là khi thực hiện như phần in đậm thì sau khi làm lạnh trong đá hai phút ADN tồn tại ở dạng sợi đơn hay sợi kép, nếu cả hai thì chủ yếu là thành phần nào? Câu hỏi tương tự đối với lúc lai ở 65 độ?
Sợi đơn bạn ạ.
Về nguyên tắc thì sợi DNA chỉ reanneal khi nhiệt độ giảm từ từ và nồng độ muối cao (bạn có thể search google). Còn làm lạnh đột ngột thế này thì đa số sẽ ở sợi đơn. Khi bạn cho vào chai lai ở 65 độ, sẽ có trường hợp DNA reanneal với nhau, có trường hợp sẽ hybridize với samples. Vì samples nằm cố định trên màng nên tôi đoán nó dễ bắt cặp hơn vì dù sao 65 độ cũng đủ để các phân tử chuyển động nhiệt lung tung rồi.
Khi làm Northern, tôi thường sử dụng PC để kiểm tra chất lượng probe. PC là template để làm probe (probe được tổng hợp bằng phương pháp random primer extension), với lượng khoảng 1/10 lượng sẽ sử dụng trong phản ứng làm probe. Để làm PC chỉ cần đun 1 lượng template vừa đủ dùng ở 100 độ trong 10 phút rồi snap vào đá 2-5 phút, sau đó xử lý hệt như đó là mẫu RNA. Sau khi lai và rửa màng xong tôi thường dùng Isotope detector dí vào chỗ có PC. Thằng này rất mạnh vì lượng nó gấp nhiều lần so với lượng mRNA đích vì thế nó sẽ làm detector "ré lên". Khi đó là yên tâm sẽ có kết quả đẹp.
Về nguyên tắc thì sợi DNA chỉ reanneal khi nhiệt độ giảm từ từ và nồng độ muối cao (bạn có thể search google). Còn làm lạnh đột ngột thế này thì đa số sẽ ở sợi đơn. Khi bạn cho vào chai lai ở 65 độ, sẽ có trường hợp DNA reanneal với nhau, có trường hợp sẽ hybridize với samples. Vì samples nằm cố định trên màng nên tôi đoán nó dễ bắt cặp hơn vì dù sao 65 độ cũng đủ để các phân tử chuyển động nhiệt lung tung rồi.
Khi làm Northern, tôi thường sử dụng PC để kiểm tra chất lượng probe. PC là template để làm probe (probe được tổng hợp bằng phương pháp random primer extension), với lượng khoảng 1/10 lượng sẽ sử dụng trong phản ứng làm probe. Để làm PC chỉ cần đun 1 lượng template vừa đủ dùng ở 100 độ trong 10 phút rồi snap vào đá 2-5 phút, sau đó xử lý hệt như đó là mẫu RNA. Sau khi lai và rửa màng xong tôi thường dùng Isotope detector dí vào chỗ có PC. Thằng này rất mạnh vì lượng nó gấp nhiều lần so với lượng mRNA đích vì thế nó sẽ làm detector "ré lên". Khi đó là yên tâm sẽ có kết quả đẹp.
Ho Huu Tho
Senior Member
Em thử search nhưng chưa được, em vẫn muốn biết cơ chế của nguyên tắc đó. Anh Lương chỉ giùm em cái đường link với ạ.
Anh Lương bỏ qua, cho em hỏi PC là viết tắt của chữ gì đấy ạ?
PC = Positive control.
Ví dụ ở trên 1 forum nó trả lời:
When you heat the DNA to 100 degrees the large input of energy is sufficient to break the hydrogen bonds between the bases that keep the two strands together. Slow cooling promotes annealing of the two strands as this energy is gradually lost. However, upon rapid cooling, the two strands do not get the chance to form the necessary hydrogen bonds between all the complementary bases of the particular sequence and then DNA remains denatured.
At a guess forming the correct hydrogen bonds is a dynamic process that only stops when the correct bonding is formed. Snap cooling can't give the DNA a chance of finding the correct antisense sequence, therefore it remains single stranded.
Đâu đó trong cuốn Lodish Molecular cell biology cũng có đề cập đến cái này ở phần hybridization.
Hoặc nguồn chính thống hơn:
http://books.google.com/books?id=-A...stranded DNA + heating + snap cooling&f=false
Ví dụ ở trên 1 forum nó trả lời:
When you heat the DNA to 100 degrees the large input of energy is sufficient to break the hydrogen bonds between the bases that keep the two strands together. Slow cooling promotes annealing of the two strands as this energy is gradually lost. However, upon rapid cooling, the two strands do not get the chance to form the necessary hydrogen bonds between all the complementary bases of the particular sequence and then DNA remains denatured.
At a guess forming the correct hydrogen bonds is a dynamic process that only stops when the correct bonding is formed. Snap cooling can't give the DNA a chance of finding the correct antisense sequence, therefore it remains single stranded.
Đâu đó trong cuốn Lodish Molecular cell biology cũng có đề cập đến cái này ở phần hybridization.
Hoặc nguồn chính thống hơn:
http://books.google.com/books?id=-A...stranded DNA + heating + snap cooling&f=false
Vũ Thị Hoàn
Senior Member
Chao ca nha,
Hom nay minh da co ket qua my man cho cai thi nghiem nay rui. Thuc ra tu truoc den gio moi thu deu tot, chi co cai quan trong nhat la cai may reader la lam viec khong tot thoi. Vi no ma minh da ton bao nhieu cong suc, tuong nhu phai give up.
Cam on moi nguoi da co nhung y kien dong gop quy bau.
Hom nay minh da co ket qua my man cho cai thi nghiem nay rui. Thuc ra tu truoc den gio moi thu deu tot, chi co cai quan trong nhat la cai may reader la lam viec khong tot thoi. Vi no ma minh da ton bao nhieu cong suc, tuong nhu phai give up.
Cam on moi nguoi da co nhung y kien dong gop quy bau.
