Ly trích DNA từ lá tiêu

[Huỳnh Chấn Khôn]

Chào các anh (chị) và các bạn.
Khôn đang làm đề tài về "nghiên cứu đa dạng di truyền cây tiêu bằng kỹ thuật RAPD". Khôn ly trích DNA theo quy trình CTAB cải tiến như sau:
Nghiền 0,1 g lá trong Nitơ lỏng, và thêm vào 1 ml dung dịch 2X CTAB đã được đun nóng ở 65 độ C.
Mẫu được ủ trong 1 h ở 65 độ C.
Ly tâm ở 11.000 vòng trong 15 phút. Hút dịch nổi chuyển sang eppendolf mới.
Sau đó thêm vào 500 ul phenol/chloroform (1:1), lắc đều
Ly tâm trong 15 phút ở 11.000 vòng/phút, 15 phút ,4 độ C.
Hút dịch nổi và tủa DNA bằng cách thêm vào 500 ul isopropanol, để ở 4 độ C trong 15 – 30 phút.
Ly tâm thu tủa ở 5000 vòng trong 15 phút, 4 độ C.
Rửa lại DNA bằng ethanol 70%.
Ly tâm và để khô. Sau đó hòa trong dung dịch 0,1X TE.
Bảo quản mẫu ở -20 độ C.

Dung dịch CTAB của  Khôn dùng có thành phần như sau:
2% w/v CTAB
1,4M NaCl
100 mM Tris – HCl pH 8.0
20mM EDTA
2% PVP
0,1% v/v β – mercaptoethanol

Lúc đầu thì ly trích không gặp vấn đề gì trục trặc. Nhưng bây giờ tự nhiên không hiểu sao khi thêm phenol/chloroform vào, ly tâm xong thì vẫn còn cặn lơ lửng ở phía trên cùng.Nó giống như có đến 4 pha thay vì 3 pha. Khôn có thử ly tâm ở tốc độ cao hơn là 15.000 nhưng vẫn không cải thiện gì.
Với lại gần đây khi đến bước tủa isopropanol,ly tâm thu tủa thì tủa có màu đen với màu trắng, hình như nó là chất gì trong lá tiêu còn lại. các anh chị có cách nào khắc phục được 2 tình trạng trên ko? Giúp em với. 5/7 này là em phải nộp báo cáo rồi mà giờ ly trích vẫn chưa tốt. lo quá.
Em cám ơn các anh chị và các bạn nhiều.

 

[Dương Văn Cường]

Lúc đầu thì ly trích không gặp vấn đề gì trục trặc.

Nói vậy tức là em đã từng thành công đúng không? Nếu đúng vậy tức là quy trình của em là ổn rồi, xem lại hóa chất thôi. Như những gì em viết thì anh nghi nhất là phenol/chloroform của em có vấn đề. Pha lọ mới mà dùng.

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Anh Cường ơi, em có pha lại phenol để dùng rồi.Nhưng nó cũng vẫn bị.Em để ý thấy là hình như lúc bị lúc không. Nhưng không bị thì ít khi lắm.Em có hỏi mấy anh chị trong phòng thí nghiệm thì họ bảo là chắc trong lá tiêu có chất gì đó nh3 nên không lắng xuống được.Một đứa bạn của em làm trên cây đước cũng bị tình trạng này, nhưng nó bảo là ít khi bị nên không quan tâm lắm.

 

[Dương Văn Cường]

Vậy thì phải chờ các anh chị có kinh nghiệm làm ly trích DNA từ lá cây trả lời em rồi. Anh chỉ có kinh nghiệm tách plasmid từ E. coli (dễ nhất trên đời) nên không giúp em được.

 

[Trần Hoàng Dũng]

Lúc em pha phenol có cho chất chống oxy hóa không( 8-hydroxyquinoline 0,1%), quá trình chuẩn bị phenol rất cực vì cần dùng Tris pH 8,5 rồi 8 rồi 7,5 chuẩn độ; rồi phải đo pH của phenol sao cho nó trên 8 mới dùng được, em có làm như vậy kô? hay chỉ đổ phenol với chloroform?

Tui đã từng chuẩn bị Phenol:Chloroform và rất sợ thằng này vì rất độc, thay vào đó lab tui chỉ dùng chloroform:isoamyl alcohol mà vẫn tách DNA ngon lành.

01- Coi lại phenol, hỏi lại coi cách mà lab em pha phenol thế nào?

02- Thử dùng chloroform:isoamylalcohol (kô cần phenol) rồi lặp lại quá trình tách.

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Đây là cách em pha ?phenol:
Cân 100g phenol, đun ở 80 độ C để cho phenol tan ra.
Thêm 100ml Tris - HCl 0.5M pH 8.0 vào,khuấy trong 20 phút
Chờ khoảng 2 -3 tiếng, hút phần dung dịch ở trên bỏ đi.
Thêm vào tiếp 100 ml Tris - HCl 0,1M pH 8.0, khuấy trong 20 phút. Chờ 2-3 tiếng để tách thành 2 pha rồi lại hút phần dung dịch ở trên bỏ đi.
Lặp lại bước trên khoảng 3 -4 lần, chuẩn độ bằng giấy quỳ.
Nếu pH của phenol trên 7,8 là đạt.
Sau cùng thêm vào khoảng 10ml Tris-HCl 0,1 M có chứa 0,5% beta-mercaptroethanol.

sau khi pha xong phenol thì em cho 100ml chloroform vào lắc đều lên và dùng.

Anh Dũng ơi, cách pha của em như vậy có đúng không?
Em có thử dùng chloroform-isoamylalcohol rồi, nhưng khi ly tâm và hút phần dịch thì dịch có màu xanh rất đậm. Em nghĩ là nó không đủ mạnh để loại các hợp chất có trong lá tiêu nên mới dùng lại phenol-chloroform. Hay để em thử dùng Chloroform-isoamylalcohol trước, sau đó hút phần dịch nổi rồi lại cho phenol-chloroform vào xem có cải tiện không. Anh Dũng thấy em làm vậy có được không?
Em xin cám ơn anh Cường và anh Dũng.

 

[Trần Hoàng Dũng]

về cơ bản em pha Phenol là đúng rồi, chỉ là thiếu bước cho chất chống oxy hóa với lại em kô cần để 2-3 tiếng vậy đâu, như thế có mà cả ngày mới xong. Sau khi cho Tris vào phenol em vortex nó rồi ly tâm sẽ giúp em tiết kiệm khá nhiều thời gian.

Khi

"chloroform-isoamylalcohol rồi, nhưng khi ly tâm và hút phần dịch thì dịch có màu xanh rất đậm"

là chuyện bình thường, đó là do sự hiện diện của các sắc tố có trong lá điều thôi, nó kô ảnh hưởng đến DNA của em sau khi tách.

Nếu đã nghi ngờ phenol bị hư mà còn dùng nó để tách DNA thì e là không xong.

Khi em dùng ?chloroform-isoamylalcohol để tách DNA, coi như dịch nổi đã tương đối sạch, nhưng sau đó em cho phenol mà chúng ta nghi ngờ đã hư thì dịch nổi lại "dơ" như cũ.

Có hai cách:

01- Tui vẫn thường tách DNA ở bước đầu bằng cách dùng hỗn hợp phenol :chloroform-isoamylalcohol ?rồi ngay sau đó dùng tiếp chloroform-isoamylalcohol, kế đến mới tủa bằng isopropanol, em thử xem.

02- Không dùng đến phenol, em cứ dùng chloroform-isoamylalcohol ?bình thường, tách vài lần để phần interface không còn vết đục là được, sau đó tủa DNA bằng isopropanol.

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Em cám ơn anh Dũng, để em thử làm theo cách anh chỉ xem sao.