Huỳnh Chấn Khôn
Senior Member
Chào các anh (chị) và các bạn.
Khôn đang làm đề tài về "nghiên cứu đa dạng di truyền cây tiêu bằng kỹ thuật RAPD". Khôn ly trích DNA theo quy trình CTAB cải tiến như sau:
Nghiền 0,1 g lá trong Nitơ lỏng, và thêm vào 1 ml dung dịch 2X CTAB đã được đun nóng ở 65 độ C.
Mẫu được ủ trong 1 h ở 65 độ C.
Ly tâm ở 11.000 vòng trong 15 phút. Hút dịch nổi chuyển sang eppendolf mới.
Sau đó thêm vào 500 ul phenol/chloroform (1:1), lắc đều
Ly tâm trong 15 phút ở 11.000 vòng/phút, 15 phút ,4 độ C.
Hút dịch nổi và tủa DNA bằng cách thêm vào 500 ul isopropanol, để ở 4 độ C trong 15 – 30 phút.
Ly tâm thu tủa ở 5000 vòng trong 15 phút, 4 độ C.
Rửa lại DNA bằng ethanol 70%.
Ly tâm và để khô. Sau đó hòa trong dung dịch 0,1X TE.
Bảo quản mẫu ở -20 độ C.
Dung dịch CTAB của Khôn dùng có thành phần như sau:
2% w/v CTAB
1,4M NaCl
100 mM Tris – HCl pH 8.0
20mM EDTA
2% PVP
0,1% v/v β – mercaptoethanol
Lúc đầu thì ly trích không gặp vấn đề gì trục trặc. Nhưng bây giờ tự nhiên không hiểu sao khi thêm phenol/chloroform vào, ly tâm xong thì vẫn còn cặn lơ lửng ở phía trên cùng.Nó giống như có đến 4 pha thay vì 3 pha. Khôn có thử ly tâm ở tốc độ cao hơn là 15.000 nhưng vẫn không cải thiện gì.
Với lại gần đây khi đến bước tủa isopropanol,ly tâm thu tủa thì tủa có màu đen với màu trắng, hình như nó là chất gì trong lá tiêu còn lại. các anh chị có cách nào khắc phục được 2 tình trạng trên ko? Giúp em với. 5/7 này là em phải nộp báo cáo rồi mà giờ ly trích vẫn chưa tốt. lo quá.
Em cám ơn các anh chị và các bạn nhiều.
Khôn đang làm đề tài về "nghiên cứu đa dạng di truyền cây tiêu bằng kỹ thuật RAPD". Khôn ly trích DNA theo quy trình CTAB cải tiến như sau:
Nghiền 0,1 g lá trong Nitơ lỏng, và thêm vào 1 ml dung dịch 2X CTAB đã được đun nóng ở 65 độ C.
Mẫu được ủ trong 1 h ở 65 độ C.
Ly tâm ở 11.000 vòng trong 15 phút. Hút dịch nổi chuyển sang eppendolf mới.
Sau đó thêm vào 500 ul phenol/chloroform (1:1), lắc đều
Ly tâm trong 15 phút ở 11.000 vòng/phút, 15 phút ,4 độ C.
Hút dịch nổi và tủa DNA bằng cách thêm vào 500 ul isopropanol, để ở 4 độ C trong 15 – 30 phút.
Ly tâm thu tủa ở 5000 vòng trong 15 phút, 4 độ C.
Rửa lại DNA bằng ethanol 70%.
Ly tâm và để khô. Sau đó hòa trong dung dịch 0,1X TE.
Bảo quản mẫu ở -20 độ C.
Dung dịch CTAB của Khôn dùng có thành phần như sau:
2% w/v CTAB
1,4M NaCl
100 mM Tris – HCl pH 8.0
20mM EDTA
2% PVP
0,1% v/v β – mercaptoethanol
Lúc đầu thì ly trích không gặp vấn đề gì trục trặc. Nhưng bây giờ tự nhiên không hiểu sao khi thêm phenol/chloroform vào, ly tâm xong thì vẫn còn cặn lơ lửng ở phía trên cùng.Nó giống như có đến 4 pha thay vì 3 pha. Khôn có thử ly tâm ở tốc độ cao hơn là 15.000 nhưng vẫn không cải thiện gì.
Với lại gần đây khi đến bước tủa isopropanol,ly tâm thu tủa thì tủa có màu đen với màu trắng, hình như nó là chất gì trong lá tiêu còn lại. các anh chị có cách nào khắc phục được 2 tình trạng trên ko? Giúp em với. 5/7 này là em phải nộp báo cáo rồi mà giờ ly trích vẫn chưa tốt. lo quá.
Em cám ơn các anh chị và các bạn nhiều.