Giới thiệu SSH

[Dương Văn Cường]

Anh nghĩ sao nếu ta kết hợp SSH với real-time --> real-time SSH (như kiểu real-time PCR) để giúp giải quyết vấn đề (3)?

Trong các bài báo mà tôi đọc thì SSH luôn đi cùng Realtime PCR. Đây là một cặp bài trùng như kết hợp Dương Quá - Tiểu Long Nữ mới thi triển được Ngọc nữ kiếm pháp  

Ý Hưng về SSH-Realtime để rạo ra Realtime SSH là thế nào? Có thể trình bày chi tiết hơn không. Biết đâu lại đăng ký được quả patent  :idea:

 

[Phan Minh Duy]

Cường chịu thua hơi sớm rồi đó  

Cường viết:

SSH là viết tắt của Supression Subtractive Hybridization (chịu không dịch sang tiếng Việt được). Đây là một phương pháp cho phép phát hiện sự khác biệt về mức độ biểu hiện gene bằng cách so sánh 2 "quần thể" cDNA.

Phân tích:
1) Nhấn mạnh ở đây:"...phát hiện sự khác biệt về mức độ biểu hiện gene..."
2) so sánh với: "phát hiện sự khác biệt về biểu hiện gene"
3) và "phát hiện mức độ khác biệt về biểu hiện gene"

Tôi nghĩ là Duy muốn dùng câu 3) để diển giải câu 1) của Cường. Thực ra câu 1) và 2) tương đương về nghĩa và hoàn toàn khác với câu 3). Tôi đứng về cách dịch của Cường nhưng câu 2) có vẽ gọn hơn và kinh tế hơn.

Em lại nghĩ khác một chút, đồng ý với câu số 2 của anh, nhưng câu 1 và câu 3 theo em lại gần nhau hơn. Chắc có lẽ em bị ám ảnh chữ "mức độ". Thôi xin dừng vụ bàn cãi về chữ nghĩa ở đây, nếu anh đồng ý.

Còn về vấn đề ngưỡng phát hiện của microarray, nó cũng rất nhạy.  Microarray có thể phát hiện sự thay đổi của trên dưới 10000 mRNA khác nhau, bao gồm mRNA có số copy rất ít đến rất cao của toàn bộ mRNA trong tế bào. Do đó ngưỡng phát hiện có thể không phải là câu trả lời.  Nhưng vẫn cám ơn Hưng.

Nói về ngưỡng phát hiện thì chắc là phải có thí nghiệm so sánh mới quyết định được, nói như vầy thì cả hai bên đều chỉ dẫn lý thuyết chắc khó bên nào thuyết phục được bên nào. Như bản thân em, cũng viện lý thuyết, thì nghiêng về hướng SSH nhạy hơn, vì bước cuối của nó còn có một lần PCR, như thế đã khuyếch đại "tín hiệu" lên gấp nhiều lần.

Microarray chủ yếu phát hiện mức độ thay đổi của mRNA (tỉ lệ mRNA giữa 2 quần thể), do đó nó cũng có thể phát hiện mRNA mới.  Tuy nhiên, vì nó chỉ cho biết tỉ lệ giữa hai mức độ mRNA, tỉ lệ này phải thật là cao mới có thể gợi ý là một mRNA mới đã xuất hiện.  Duy đã nói là nó không thể và tôi muốn đính chính lại chổ này.

Chính vì ý đồ thiết kế microarray là để phát hiện mức độ thay đổi, và rằng nếu mRNA mới xuất hiện thì tỉ lệ phải thật cao (điều này chỉ là "hy vọng" vì đến giờ phút này mà có mRNA mới thì chắc nó cũng phải là "hàng hiếm" mới chưa bị người ta phát hiện) nên khi nói không thể không phải là không có cái lý của nó (mặc dù không nhớ là em dám hùng hồn "tuyên bố" vụ microarray không thể phát hiện mRNA mới khi nào, nhiều khi không thể nhớ là mình đã nói gì, viết gì). Còn một lý do khác mà em "nói" microarray không thể phát hiện mRNA mới, đó là em bàn đến mRNA ở mức độ một transcript. Như em đã viết lúc đầu, hiện nay biên giới giữa các gene của eukaryote ngày càng mờ nhạt, các transcript có thể là sản phẩm của sự kết hợp nhiều exon nằm cách xa nhau đến nỗi người ta không hề nghĩ là việc này có thể xảy ra (và vì thế đương nhiên các exon này được xếp nằm trên các gene khác nhau). Thử nghĩ, các transcript này nếu bỏ vào microarray thì sao? một đoạn này của nó sẽ lai với trình tự của gene A trong khi đoạn khác của nó lai với trình tự của gene X, thử hỏi khi này cần nó xuất hiện với mức độ thế nào thì mới gợi ý được là có một mRNA mới xuất hiện, hay là ta chỉ cho rằng gene A và X đồng thời tăng biểu hiện  hoặc tệ hơn nữa là do chia làm nhiều phần bắt cặp ở nhiều nơi nên ta chỉ cho rằng đó là "noise" không để ý đến. Đây theo em cũng là một nguyên nhân chính làm nên điểm mạnh của SSH so với microarray (cùng với việc không phụ thuộc vào trình tự đã biết)

Đây cũng là lý do vì sao em hỏi có giới hạn về độ dài của transcript mà SSH phát hiện được hay không, vì càng phát hiện được transcript lớn ta càng có nhiều thông tin về sự kết hợp "bất ngờ" giữa các exon.

Anh nghĩ sao nếu ta kết hợp SSH với real-time --> real-time SSH (như kiểu real-time PCR) để giúp giải quyết vấn đề (3)?

có lẽ bạn muốn dùng realtime PCR ở bước cuối thay vì dùng PCR để phát hiện luôn không những mRNA mới mà còn số lượng của nó nữa? tôi cũng từng nghĩ đến điểm này, nhưng vì trong nguyên tắc ban đầu có nói là dùng lượng dư driver nên không nghĩ là dùng realtime sẽ đem lại kết quả có ý nghĩa. Câu tôi muốn hỏi là tại sao lại dùng lượng dư? nếu dùng lượng ngang nhau (như microarray) chẳng phải ta sẽ so sánh được mức độ biểu hiện sao?

Do đó nếu kết hợp SSH với microarray sẽ rất tuyệt. SSH khắc phục được nhược điểm độ nhạy của microarray, microarray giúp giảm rất nhiều thời gian vì sau khi SSH không phải clone và sequencing hàng ngàn dòng.

Xin lỗi tôi chưa hiểu được ý kết hợp SSH và microarray của bạn Hưng đưa ra nhất là chỗ "microarray giúp giảm rất nhiều thời gian vì sau khi SSH không phải clone và sequencing hàng ngàn dòng."

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Ý tôi về cái real-time SSH chỉ là bước PCR của SSH dùng real-time PCR. Vì tôi chưa đọc bài báo nào về SSH nên không biết

Trong các bài báo mà tôi đọc thì SSH luôn đi cùng Realtime PCR. Đây là một cặp bài trùng như kết hợp Dương Quá - Tiểu Long Nữ mới thi triển được Ngọc nữ kiếm pháp ?

Về ý kết hợp SSH với microarray thì thế này

Sau SSH bạn có một đống đoạn DNA. Để nhận dạng mặt mũi nó thế nào sau đó suy luận ra sự khác biệt về biểu hiện gene thì phải tách dòng và đọc trình tự chúng. Thay vì đó ta thiết kế một array với các probes trên đó rồi lai "sản phẩm" SSH với array này và đọc kết quả.

 

[Ngô Vũ]

Tôi nghĩ là SSH có thể làm số 1 và 2 nhưng không thể làm được số 3. ?Các bạn có giải thích được không qua sơ đồ minh họa mà Cường đưa lên?

Vâng, cái số 2 chỉ cần lật ngược lại, dùng thể đột biến làm driver và dùng kiểu gene hoang dại làm tester.

Cường, exactly!

Còn về phần số 3, tức là SSH có xác định được tăng giảm số lượng bản sao? ?Vì số lượng bản sao ở quần thể DRIVER được dùng ở lượng dư thừa nên pp này sẽ không làm được phần số 3 này. ?Thử xem thí dụ dưới đây:

Trường hợp 1:
DRIVER (copy#) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? TESTER (copy#)
gene A (1) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?gene A (1)
gene B (1) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?gene B (1)
gene C (1) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?gene C (1)
gene D (1) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?gene D (10)
Nếu quần thể driver có số bản sao bằng với quần thể tester: sự tăng biểu hiện của gene D sẽ được phát hiện qua pp SSH sau khi lai và loại bỏ các gene không có sự thay đổi về độ biểu hiện. ?Tuy nhiên trong pp SSH, người ta dùng dư thừa DRIVER như trong trường hợp 2:

Trường hợp 2:
DRIVER (copy#) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?TESTER (copy#)
gene A (10) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?gene A (1)
gene B (10) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?gene B (1)
gene C (10) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?gene C (1)
gene D (10) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?gene D (10)
Bạn sẽ thấy, sau khi lai và loại bỏ các gene không thay đổi, gene D cũng sẽ bị loại và không được khuyết đại cho dù nó có tăng biểu hiện lên 10 lần. ?Điều này cho thấy là pp SSH chỉ cho phép phát hiện gene D khi gene này tăng độ biểu hiện gấp nhiều lần, cũng đồng nghĩa (một cách tương đối) với từ chổ biểu hiện âm tính đến biểu hiện dương tính. ?Xem trường hợp 3:

Trường hợp 3:
DRIVER (copy#) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?TESTER (copy#)
gene A (10) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?gene A (1)
gene B (10) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?gene B (1)
gene C (10) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?gene C (1)
gene D (10) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?gene D (100)

Số bản sao của gene D trong DRIVER có thể được dùng dư thừa nhưng ?cũng không đủ để bảo hòa hết số bản sao gene D tăng rất nhiều trong TESTER, và gene D do đó vẫn được phát hiện.

Vậy, trường hợp 2 trả lời rằng pp SSH không thể phát hiện sự tăng giảm số bản sao vì việc dùng DRIVER dư thừa.

Việc dùng DRIVER dư thừa là vì người ta muốn tránh dương tính giả trong quần thể TESTER. Vậy SSH không có ưu điểm bằng microarray ở chổ không phát hiện được sự tăng giảm số bản sao.


Duy viết:

hính vì ý đồ thiết kế microarray là để phát hiện mức độ thay đổi, và rằng nếu mRNA mới xuất hiện thì tỉ lệ phải thật cao (điều này chỉ là "hy vọng" vì đến giờ phút này mà có mRNA mới thì chắc nó cũng phải là "hàng hiếm" mới chưa bị người ta phát hiện) nên khi nói không thể không phải là không có cái lý của nó (mặc dù không nhớ là em dám hùng hồn "tuyên bố" vụ microarray không thể phát hiện mRNA mới khi nào, nhiều khi không thể nhớ là mình đã nói gì, viết gì). Còn một lý do khác mà em "nói" microarray không thể phát hiện mRNA mới, đó là em bàn đến mRNA ở mức độ một transcript. Như em đã viết lúc đầu, hiện nay biên giới giữa các gene của eukaryote ngày càng mờ nhạt, các transcript có thể là sản phẩm của sự kết hợp nhiều exon nằm cách xa nhau đến nỗi người ta không hề nghĩ là việc này có thể xảy ra (và vì thế đương nhiên các exon này được xếp nằm trên các gene khác nhau). Thử nghĩ, các transcript này nếu bỏ vào microarray thì sao? một đoạn này của nó sẽ lai với trình tự của gene A trong khi đoạn khác của nó lai với trình tự của gene X, thử hỏi khi này cần nó xuất hiện với mức độ thế nào thì mới gợi ý được là có một mRNA mới xuất hiện, hay là ta chỉ cho rằng gene A và X đồng thời tăng biểu hiện ?hoặc tệ hơn nữa là do chia làm nhiều phần bắt cặp ở nhiều nơi nên ta chỉ cho rằng đó là "noise" không để ý đến. Đây theo em cũng là một nguyên nhân chính làm nên điểm mạnh của SSH so với microarray (cùng với việc không phụ thuộc vào trình tự đã biết)

Đây cũng là lý do vì sao em hỏi có giới hạn về độ dài của transcript mà SSH phát hiện được hay không, vì càng phát hiện được transcript lớn ta càng có nhiều thông tin về sự kết hợp "bất ngờ" giữa các exon.

Phức tạp quá! ?mRNA mới ở đây chỉ đề cập đến biểu hiện dương tính từ âm tính, chứ đâu có nói về trình tự mới đâu.