Giới thiệu SSH

[Dương Văn Cường]

SSH là viết tắt của Supression Subtractive Hybridization (chịu không dịch sang tiếng Việt được). Đây là một phương pháp cho phép phát hiện sự khác biệt về mức độ biểu hiện gene bằng cách so sánh 2 "quần thể" cDNA.

Nguyên lý của phương pháp (nhìn hình minh họa là chính, đọc là phụ )

1. Thiết lập 1 quần thể cDNA chuẩn, tên gọi gán cho quần thể này là DRIVER.

2. Tách mRNA tổng số của đối tượng cần so sánh. Chạy RT-PCR để thu được quần thể cDNA thứ 2, tên được gán cho quần thể này là TESTER.

Thông thường trong các nghiên cứu driver là cDNA tổng số của kiểu gene hoang dại (wild style) đã được chuẩn hóa, còn Tester là cDNA tổng số của kiểu gene đột biến (mutant). Sự có mặt của một cDNA mới, sự vắng mặt của 1 cDNA vốn có hay sự khác nhau đáng kể về số lượng bản copies của 1 cDNA chính là 3 yếu tố phản ánh sự khác biệt trong biểu hiện/mức độ biểu hiện gene giữa kiểu gene hoang dại và kiểu gene đột biến.

3. Cắt tester bằng enzyme giới hạn đầu bằng.

4. Chia đôi lượng cDNA này thành 2 phần là tester A và tester B.

5. Nối tester A ở 1 đầu với 1 đoạn adapter A. Nối tester B ở 1 đầu với adapter B. Trên hình vẽ adapter A mầu vàng, adapter B mầu tím.

Các Adapter được thiết kế có tính chất inverted terminal repeats, tức là có thể lai với nhau. cDNA mạch kép với hai mạch đơn được gắn cùng 1 loại adapter sẽ tạo thành 1 cấu trúc "hình cái chảo" (pan-like structure). Với cấu trúc này thì cDNA mạch kép sẽ không thể nhân lên bằng PCR được do primers (bổ xung với adapter) không còn chỗ để bám. Hiện tượng này được gọi là PS-effect.

6. Bước loại trừ thứ nhất là loại trừ bằng hibridization: Tester A, B và driver được biến tính rồi hybridize: Driver - Tester A và Driver - Tester B. Số lượng copies của driver được cung cấp dư thừa so với tester. Những cDNA nào của tester có trình tự tương ứng với driver sẽ tạo thành kiểu tổ hợp lai mạch kép như trên hình minh họa. Những cDNA nào không có trình tự tương ứng vẫn duy trì mạch đơn. Lưu ý ở đây là có những cơ chế (tôi cũng chưa hiểu những cơ chế này) và thí nghiệm đã được thiết kế sao cho không để sót trình tự nào của tester vẫn duy trì mạch đơn nếu nó có trình tự tương ứng trong driver.

7. Bước loại trừ thứ hai là loại trừ bằng PCR: Tiếp tục trộn 2 phần này lại với nhau. Lúc này các cDNA mạch đơn còn sót lại (tức là các cDNA không có trình tự tương ứng trong driver) sẽ lai với nhau tạo thành cDNA mạch kép. Bổ xung primers. Các tổ hợp chỉ có 1 adaper hoặc không có adpater nào được tạo thành trong bước loại trừ 1 dĩ nhiên không được nhân lên vì không có primer. Các tổ hợp có hai đầu adapter giống nhau được tạo thành trong bước loại trừ 1 cũng không được nhân lên do PS-effect. Chỉ có các tổ hợp cDNA mạch kép với 2 đầu adapter khác nhau mới được nhân lên.

8. Điện di, tách dòng ... để xác định các trình tự này. Đây chính là các trình tự mới được hình thành, chỉ có ở kiểu gene đột biến chứ không có mặt trong kiểu gene hoang dại.


Bài viết còn nhiều hạn chế do bản thân tôi chưa bao giờ làm thực nghiệm, chỉ đọc một chút lý thuyết về SSH. Mong các anh em cùng mổ xẻ tiếp.


Tham khảo:

- http://www.evrogen.com/t6.shtml
- WIKI

 

[Phan Minh Duy]

Thế cách này có gì vượt trội so với quantitative realtime PCR hay microarray? theo như những gì bạn trình bày thì cách này chỉ cho thấy có hay không mà không cho thông tin về hàm lượng cDNA?

 

[Trần Hoàng Dũng]

Tui chỉ thắc mắc: vì sao chọn kỹ thuật này cùng ChIP để thảo luận mà kô là càc kỹ thuật khác? Ngẫu nhiên? đang làm về kỹ thuật nãy? hay hơn các pp khác?? Không trả lời được lời quảng cáo này, khó mà khiến người ta bỏ thời gian cho những việc chưa/không thiết thực với họ.

Chưa nói ?đến vấn để khi giới thiệu 1 vấn đề mới đó là chứng minh, tức là đưa ra 1 nc có tầm quan trọng, có chỉ số cited cao, được nhiều người quan tâm ... mà trong đó các tác giả ?có sử dụng kỹ thuật mà ta muốn giới thiệu; khi đó người nghe/đọc mới hiểu và nhờ cái mình cần nói. ?Một ông thầy giỏi là ông thầy biết chứng minh

 

[Dương Văn Cường]

Thế cách này có gì vượt trội so với quantitative realtime PCR hay microarray? theo như những gì bạn trình bày thì cách này chỉ cho thấy có hay không mà không cho thông tin về hàm lượng cDNA?

Duy nhận xét đúng. Theo những gì tôi hiểu về SSH thì nó chỉ có khả năng phát hiện các cDNA mới xuất hiện trong quần thể tester. Trong bài báo này:

Bruno et al., Endogenous targets of RNA-dỉected DNA methylation and Pol IV in Arabidopsis, The EMBO Journal, 2006.

Các tác giả đã sử dụng kết hợp cả hai phương pháp SSH và Realtime PCR. Sau khi xác định bằng SSH họ dùng Realtime PCR để confirm sự tăng về số lượng của các trình tự gene quan tâm.

Không nên so sánh trực tiếp SSH và Realtime PCR. Bắn máy bay phải dùng pháo cao xạ còn bắn tầu ngầm phải chơi thủy lôi.

Như đã nói ở trên, có 3 khả năng cần được phát hiện:

- Xuất hiện cDNA mới
- Mất đi 1 cDNA vốn có
- Tăng / giảm số lượng bản sao

thì với SSH tôi mới chỉ hiểu được ý thứ nhất, đó là xác định những đoạn cDNA mới. Tôi chưa dám kết luận SSH có thể làm được hay không làm được 2 việc 2 và 3, mong bạn nào có kinh nghiệm hơn về SSH giải đáp thắc mắc này.

-----------------

Về câu hỏi của anh Dũng, tôi đã nói rõ đơn giản là tôi có đọc qua và đưa lên, ai thích thì cùng thảo luận mổ xẻ, vậy thôi. Bản thân tôi cũng có nhiều câu hỏi, nhiều thắc mắc với SSH. Tôi không phải là thầy và không có ý định đứng mũi chịu sào ở chủ đề này.

Bài viết còn nhiều hạn chế do bản thân tôi chưa bao giờ làm thực nghiệm, chỉ đọc một chút lý thuyết về SSH. Mong các anh em cùng mổ xẻ tiếp.

 

[Phan Minh Duy]

Tầm quan trọng của SSH và điểm khiến nó trở thành một phương pháp được đề cao (ít nhất là được Cường đưa lên đây ) theo tôi chính là chỗ mà Cường đã nói: khả năng phát hiện các cDNA mới trong quần thể cDNA. Đây là khả năng mà cả micro array và realtime PCR đều không có. Trong khoa học việc quan sát được một hiện tượng gì mới luôn là tiền đề cho nhiều thành tựu sau này. Hồi bữa có đọc một bài về epigenetics (đang kiếm lại bài đó, kiếm hông ra) nói rằng biên giới giữa các gene ngày càng không rõ ràng nữa, và người ta đã tìm được các transcript là kết hợp của các exon không những nằm xa nhau trên NST mà còn có thể nằm trên các NST khác nhau. Theo như vậy thì SSH rõ ràng là có lợi thế trong việc tìm kiếm những transcript lạ này.

Một câu hỏi nữa là nếu như tôi có 3-4 transcript mới trong quần thể TESTER của mình thì làm sao trong bước PCR cuối cùng tôi có thể phân biệt được các transcript này với nhau? Nói cách khác là làm sao để biết được tôi có bao nhiêu loại transcript mới và làm sao để tách riêng chúng ra?

SSH là viết tắt của Supression Subtractive Hybridization (chịu không dịch sang tiếng Việt được). Đây là một phương pháp cho phép phát hiện sự khác biệt về mức độ biểu hiện gene bằng cách so sánh 2 "quần thể" cDNA.

Phải chăng nên sửa lại đoạn mô tả này?

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Thêm một số ưu điểm của SSH

"The use of poly(A)-based RT-PCR prevents loss of cDNAs during PCR steps of the
subtractive hybridisation procedure (Brady & Iscove, 1993; Hillarby et al., 1996) and
is improving the yield of this method (Byers et al., 2000). The technique relies on
hybridisation of cDNA sequences present in both cDNA populations which are
then removed (‘subtracted’) from the reaction. The population of cDNA species
that remains is enriched for sequences preferentially expressed in one cell or tissue
type.
The advantages of suppression subtractive hybridisation include, especially in
combination with RT-PCR, the requirement for very small amounts of mRNA,
the ability to detect mRNAs which comprise as little as 0.01 percent of the total
mRNA, and the ability to detect novel genes (Byers et al., 2000). Another advantage
is that no radioactivity is involved."

Theo Lorkowski, S., and Cullen, P. 2003 Analysing Gene Expression: A Handbook of Methods: Possibilities and Pitfalls. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.

Chạy PCR xong thì đầu tiên có thể xem kích thước trên bản điện di. Nếu các transcripts này khác nhau về kích thước thì elute ra và làm tiếp cloning, sequencing. Theo tôi giải pháp khôn ngoan nhất là tăng nồng độ và chiều dài chạy gel để tách biệt rõ ràng các đoạn với kich thước khác nhau cỡ 10, 20bp.

Có thể điện di trên gel polyacrylamide mà. Nếu dùng gel biến tính (DGGE) thì có thể phân biệt được các đoạn có cùng độ dài nhưng khác nhau về thành phần nucleotide.

Dù sao vẫn còn trường hợp các transcripts có kích thước tương đương, không thể phân biệt bằng điện di. Trường hợp này khi được đem giải trình tự với cùng một cặp mồi (chính là mồi bám vào adater) thì kết quả sẽ thế nào nhỉ? Bạn nào rành về giải trình tự thử lý giải giúp nhé.

Vấn đề kích thước có thể giải quyết bằng DGGE. Nếu giải trình tự với cùng cặp mồi mà template đưa vào khác nhau (cho dù cùng hay khác kích thước) thì trên chromatogram sẽ ra pick loằng ngoằng không được đâu.

Nếu không có DGGE thì chịu khó tách dòng rồi sàng lọc bằng RE.

 

[Ngô Vũ]

Ngày nay người ta thường dùng pp microarray để xác định mức độ thay đổi của nhiều mRNA trong tế bào dưới ảnh hưởng bởi một điều kiện thực nghiệm nào đó. Vì toàn bộ gene người đã được giải mã và người ta đã có microarray chứa toàn bộ gene, vậy tại sao người ta vẫn xài pp SSH trên mà không dùng microarray cho tiện?

 

[Dương Văn Cường]

Một câu hỏi nữa là nếu như tôi có 3-4 transcript mới trong quần thể TESTER của mình thì làm sao trong bước PCR cuối cùng tôi có thể phân biệt được các transcript này với nhau? Nói cách khác là làm sao để biết được tôi có bao nhiêu loại transcript mới và làm sao để tách riêng chúng ra?

Câu hỏi của Duy rất hay. Đúng là tôi chưa hề nghĩ đến việc này.

Trong bài báo này:

Munir et al., Suppression subtractive hybridization coupled with microarray analysis to examine differential expression of genes in virus infected cells, Biol. Proced. Online 2004;6(1): 94-104.
http://www.biologicalprocedures.com/bpo/arts/1/77/m77.pdf


Sau bước loại trừ thứ 2, toàn bộ các transcripts được nhân lên bằng PCR sẽ được ligate vào vector và biến nạp vào tế bào E.coli. Sau đó người ta chọn ngẫu nhiên 960 khuẩn lạc để nuôi và tách plasmid. Tiếp theo 960 dòng này được giải trình tự. Các trình tự kết quả được search tương đồng trên các cơ sở dữ liệu.

Nguyên văn:

cDNA cloning

The subtracted target cDNAs were ligated (27) with the pGEMT plasmid vector (Promega, Madison, Wis.) using T4 DNA ligase and transformed into maximum efficiency Escherichia coli DH5α cells (Life Technologies). The transformed bacteria were plated onto LB agar plates containing ampicillin , X-gal, IPTG, followed by overnight incubation at 37°C. pGEM-T plasmid contains LacZ reporter at the multiple cloning site and allows blue white screening. Recombinant white colonies were randomly selected and cultured in LB broth containing ampicillin followed by plasmid extraction performed with QIAwell 96-well plasmid purification system (Qiagen). A total of 960 forward and reverse subtracted clones were sequenced by automated DNA sequencing (28) at the Advanced Genetic Analysis Center, University of Minnesota. The sequences were identified based on homology searches with a range of databases including Swiss- Prot, TrEMBL, PIR, NRL-3D, and GenPept. Sequence data
were analyzed and edited for quality and vector sequences by using Phred-Phrap/Consed analysis software.

 

[Dương Văn Cường]

SSH là viết tắt của Supression Subtractive Hybridization (chịu không dịch sang tiếng Việt được). Đây là một phương pháp cho phép phát hiện sự khác biệt về mức độ biểu hiện gene bằng cách so sánh 2 "quần thể" cDNA.

Phải chăng nên sửa lại đoạn mô tả này?

Về câu này thì tôi bảo lưu ý kiến, không thay đổi. Mọi người ngẫm kỹ sẽ thấy nó ?không sai, bao hàm ý nghĩa tổng quát.

Như đã nói ở trên tôi chưa dám kết luận và cũng chưa tìm được tài liệu nào khẳng định SSH không làm được việc số 2 và 3.

Trường hợp 1 (có / không cDNA mới) nếu so sánh với trường hợp 3 (khác biệt về số lượng bản sao) trên thực tế không có ranh giới tuyệt đối. Một người nói transcript A là không được biểu hiện trong khi người khác nói nó có mặt nhưng với một số lượng copies rất ít.

Trong bài báo của Munir có câu này:

Poly (A+) mRNA from aMPV-infected cells was used as the “tester” or the population whose upregulated transcripts were to be identified and poly(A+) mRNA from control cells served as the “driver” or the population whose transcripts served as a reference for cDNA subtraction (Forward SSH library). Poly(A+) mRNA from aMPV-infected and control cells were also used conversely as driver and tester samples, respectively (Reverse SSH library). Differentially expressed cDNAs are present in the ‘tester’ cDNA but are either absent or present in very low levels in the ‘driver’ cDNAs.

 

[Guest]

Chạy PCR xong thì đầu tiên có thể xem kích thước trên bản điện di. Nếu các transcripts này khác nhau về kích thước thì elute ra và làm tiếp cloning, sequencing. Theo tôi giải pháp khôn ngoan nhất là tăng nồng độ và chiều dài chạy gel để tách biệt rõ ràng các đoạn với kich thước khác nhau cỡ 10, 20bp.

Có thể điện di trên gel polyacrylamide mà. Nếu dùng gel biến tính (DGGE) thì có thể phân biệt được các đoạn có cùng độ dài nhưng khác nhau về thành phần nucleotide.

Dù sao vẫn còn trường hợp các transcripts có kích thước tương đương, không thể phân biệt bằng điện di. Trường hợp này khi được đem giải trình tự với cùng một cặp mồi (chính là mồi bám vào adater) thì kết quả sẽ thế nào nhỉ? Bạn nào rành về giải trình tự thử lý giải giúp nhé.

Vấn đề kích thước có thể giải quyết bằng DGGE. Nếu giải trình tự với cùng cặp mồi mà template đưa vào khác nhau (cho dù cùng hay khác kích thước) thì trên chromatogram sẽ ra pick loằng ngoằng không được đâu.

Nếu không có DGGE thì chịu khó tách dòng rồi sàng lọc bằng RE.

Liệu có thể thu hồi lại DNA trên gel polyacrylamide không nhỉ? tôi chỉ toàn làm trên agarose thôi.

Sau bước loại trừ thứ 2, toàn bộ các transcripts được nhân lên bằng PCR sẽ được ligate vào vector và biến nạp vào tế bào E.coli. Sau đó người ta chọn ngẫu nhiên 960 khuẩn lạc để nuôi và tách plasmid. Tiếp theo 960 dòng này được giải trình tự. Các trình tự kết quả được search tương đồng trên các cơ sở dữ liệu.

cách giải quyết này giống như hướng giải quyết mà tôi nghĩ đến. Người ta cũng dùng cách này để sequence các bộ gene.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Liệu có thể thu hồi lại DNA trên gel polyacrylamide không nhỉ? tôi chỉ toàn làm trên agarose thôi.

Có thể.

Ông Anonymous này là ai thế nhỉ?

 

[Phan Minh Duy]

Liệu có thể thu hồi lại DNA trên gel polyacrylamide không nhỉ? tôi chỉ toàn làm trên agarose thôi.

Có thể.

Ông Anonymous này là ai thế nhỉ?

Hì, là tôi đấy, không hiểu tại sao bài đó lại không hiện tên tôi ra nhỉ? hay là ai đó thấy tôi hỏi ngớ ngẩn quá nên giấu dùm ... tôi chưa làm và chưa biết thì tôi nói chưa biết, không việc gì phải giấu cả.

Cách dùng gel polyacrylamide có giới hạn là đoạn trình tự đó kích thước không được lớn quá (hình như chỉ nên dùng cho đoạn kích thước nhỏ hơn 400bp). Nói đến đây mới tự hỏi liệu đoạn cDNA đó dài quá thì sao nhỉ, SSH có khả năng phát hiện được không?

 

[Phan Minh Duy]

SSH là viết tắt của Supression Subtractive Hybridization (chịu không dịch sang tiếng Việt được). Đây là một phương pháp cho phép phát hiện sự khác biệt về mức độ biểu hiện gene bằng cách so sánh 2 "quần thể" cDNA.

Phải chăng nên sửa lại đoạn mô tả này?

Về câu này thì tôi bảo lưu ý kiến, không thay đổi. Mọi người ngẫm kỹ sẽ thấy nó  không sai, bao hàm ý nghĩa tổng quát.

Như đã nói ở trên tôi chưa dám kết luận và cũng chưa tìm được tài liệu nào khẳng định SSH không làm được việc số 2 và 3.

Trường hợp 1 (có / không cDNA mới) nếu so sánh với trường hợp 3 (khác biệt về số lượng bản sao) trên thực tế không có ranh giới tuyệt đối. Một người nói transcript A là không được biểu hiện trong khi người khác nói nó có mặt nhưng với một số lượng copies rất ít.

Trong bài báo của Munir có câu này:

Poly (A+) mRNA from aMPV-infected cells was used as the “tester” or the population whose upregulated transcripts were to be identified and poly(A+) mRNA from control cells served as the “driver” or the population whose transcripts served as a reference for cDNA subtraction (Forward SSH library). Poly(A+) mRNA from aMPV-infected and control cells were also used conversely as driver and tester samples, respectively (Reverse SSH library). Differentially expressed cDNAs are present in the ‘tester’ cDNA but are either absent or present in very low levels in the ‘driver’ cDNAs.

Khi nói đến một phương pháp phát hiện gì đó thì người ta sẽ thường cho biết luôn ngưỡng phát hiện của nó. Nếu lượng cDNA (chẳng hạn) nằm dưới ngưỡng đó thì người ta sẽ kết luận là không phát hiện được cDNA bằng phương pháp này hay cẩu thả hơn thì nói là không có cDNA (ngầm hiểu là không có cDNA theo phương pháp mà họ đã làm). Bởi vậy câu "Một người nói transcript A là không được biểu hiện trong khi người khác nói nó có mặt nhưng với một số lượng copies rất ít" chỉ chấp nhận được khi họ nói về cùng một transcript nhưng cách phát hiện khác nhau mà thôi, nếu họ dùng mọi thứ từ tế bào đến các điều kiện thí nghiệm đều y như nhau mà kết luận như thế thì cả hai đều phải coi lại.

Khi nói một phương pháp cho phép phát hiện sự khác biệt về mức độ biểu hiện tức là phải cho biết rõ ít nhất là sự so sánh hơn, kém bao nhiêu lần (mức độ). Câu của Munir mà bạn trích dẫn không hề có hàm ý rằng SSH phát hiện được sự khác biệt về mức độ biểu hiện của cDNA mà chỉ giải thích rằng do cDNA của tester nhiều mà cDNA trong driver hoặc không có hoặc có rất ít nên SSH có thể phát hiện được cDNA trong tester mà thôi. Bạn chưa thể thuyết phục được tôi là SSH có thể cho tôi biết thông tin như thế nên tôi không nghĩ câu mô tả trên của bạn là "bao hàm ý nghĩa tổng quát". Theo tôi, nó "không chính xác".

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Hì, là tôi đấy, không hiểu tại sao bài đó lại không hiện tên tôi ra nhỉ? hay là ai đó thấy tôi hỏi ngớ ngẩn quá nên giấu dùm ... tôi chưa làm và chưa biết thì tôi nói chưa biết, không việc gì phải giấu cả.

Tôi đâu có ý nói giấu, hỏi lại xem có phải diễn đàn bị lỗi không để kiếm việc cho đồng chí Cường làm

Cách dùng gel polyacrylamide có giới hạn là đoạn trình tự đó kích thước không được lớn quá (hình như chỉ nên dùng cho đoạn kích thước nhỏ hơn 400bp). Nói đến đây mới tự hỏi liệu đoạn cDNA đó dài quá thì sao nhỉ, SSH có khả năng phát hiện được không?

Đúng là có giới hạn về kích thước nhưng giới hạn trên là khoảng 1kb.

 

[Dương Văn Cường]

Cảm ơn Duy. Những phân tích của Duy rất thuyết phục.

Điểm khác biệt cơ bản trong cách suy suận của tôi và Duy là ở chỗ Duy đặt sự việc trong phạm vi một phương pháp nghiên cứu cụ thể, còn tôi thì không.

Vấn đề bây giờ là làm sao thuyết phục được mọi người rằng SSH phát hiện được sự khác biệt ở mức độ biểu hiện gene. Để làm được việc này cần phải định nghĩa được một cách đúng đắn thế nào là khác biệt về mức độ biểu hiện gene. Cách suy luận của tôi đúng hay của Duy đúng.


Tạm thời tôi cung câp thêm các dữ liệu này:

Suppression Subtractive Hybridization (SSH) is a powerful technique to identify a set of genes differentially expressed in two cell samples in the absence of sequence information.
http://hugroup.cems.umn.edu/Research/genomics/ssh.htm

Suppression subtractive hybridization: a versatile method for identifying differentially expressed genes.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/...ve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10349654

In higher eukaryotes, biological processes such as cellular growth and organogenesis are mediated by differential gene expression. To understand molecular regulation of these processes, differentially expressed genes of interest must be identified, cloned, and studied in detail. Subtractive cDNA hybridization has been a powerful tool in the identification and analysis of differentially expressed cDNAs.
http://www.evrogen.com/t6.shtml

These results suggest that the SSH technique is applicable to many molecular genetic and positional cloning studies for the identification of disease, developmental, tissue-specific, or other differentially expressed genes.
http://www.pnas.org/cgi/content/short/93/12/6025


Tất cả những tài liệu trên khi nhắc đến SSH đều sử dụng cụm từ "differentially expressed".

 

[Dương Văn Cường]

Okie, tôi sai rồi. Differentially expressed phải được hiểu là "được biểu hiện một cách khác nhau" chứ không được tùy tiện thêm vào chữ "mức độ".

?

Kết thúc vấn đề ngôn ngữ. Quay lại bản chất vấn đề. Hiện nay còn những câu hỏi sau cần tiếp tục tìm hiểu.


1. Câu hỏi của anh Ngô Vũ đưa ra:

Ngày nay người ta thường dùng pp microarray để xác định mức độ thay đổi của nhiều mRNA trong tế bào dưới ảnh hưởng bởi một điều kiện thực nghiệm nào đó. Vì toàn bộ gene người đã được giải mã và người ta đã có microarray chứa toàn bộ gene, vậy tại sao người ta vẫn xài pp SSH trên mà không dùng microarray cho tiện?

2. Ngưỡng phát hiện của SSH?

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

2. Ngưỡng phát hiện của SSH?

The advantages of suppression subtractive hybridisation include, especially in
combination with RT-PCR, the requirement for very small amounts of mRNA,
the ability to detect mRNAs which comprise as little as 0.01 percent of the total
mRNA, and the ability to detect novel genes (Byers et al., 2000). Another advantage is that no radioactivity is involved.

Có thể coi phần bôi đen là ngưỡng phát hiện chăng?

1. Câu hỏi của anh Ngô Vũ đưa ra:

Trích dẫn:
Ngày nay người ta thường dùng pp microarray để xác định mức độ thay đổi của nhiều mRNA trong tế bào dưới ảnh hưởng bởi một điều kiện thực nghiệm nào đó. Vì toàn bộ gene người đã được giải mã và người ta đã có microarray chứa toàn bộ gene, vậy tại sao người ta vẫn xài pp SSH trên mà không dùng microarray cho tiện? ?

Câu trả lời có thể nằm ở ngưỡng phát hiện. Khi dùng microarray để xác định sự biểu hiện gene khác nhau dưới các điều kiện khác nhau người ta tách mRNA rồi chuyền thành cDNA, đánh dấu huỳnh quang rồi lai với array. Trong đó không có bước khuếch đại. Do vậy bị giới hạn về mặt độ nhạy.

Do đó nếu kết hợp SSH với microarray sẽ rất tuyệt. SSH khắc phục được nhược điểm độ nhạy của microarray, microarray giúp giảm rất nhiều thời gian vì sau khi SSH không phải clone và sequencing hàng ngàn dòng.

 

[Ngô Vũ]

Cường chịu thua hơi sớm rồi đó ?

Cường viết:

SSH là viết tắt của Supression Subtractive Hybridization (chịu không dịch sang tiếng Việt được). Đây là một phương pháp cho phép phát hiện sự khác biệt về mức độ biểu hiện gene bằng cách so sánh 2 "quần thể" cDNA.

Phân tích:
1) Nhấn mạnh ở đây:"...phát hiện sự khác biệt về mức độ biểu hiện gene..."
2) so sánh với: "phát hiện sự khác biệt về biểu hiện gene"
3) và "phát hiện mức độ khác biệt về biểu hiện gene"

Tôi nghĩ là Duy muốn dùng câu 3) để diển giải câu 1) của Cường. Thực ra câu 1) và 2) tương đương về nghĩa và hoàn toàn khác với câu 3). Tôi đứng về cách dịch của Cường nhưng câu 2) có vẽ gọn hơn và kinh tế hơn.

Ở các hội nghị quốc tế lâu lâu người ta cũng lâm vào tình trạng cãi nhau về ngôn ngữ như thế, gọi là "semantic". ?

Rất đồng ý với Hưng về sự kết hợp SSH với microarray.

Còn về vấn đề ngưỡng phát hiện của microarray, nó cũng rất nhạy. ?Microarray có thể phát hiện sự thay đổi của trên dưới 10000 mRNA khác nhau, bao gồm mRNA có số copy rất ít đến rất cao của toàn bộ mRNA trong tế bào. Do đó ngưỡng phát hiện có thể không phải là câu trả lời. ?Nhưng vẫn cám ơn Hưng.

Microarray chủ yếu phát hiện mức độ thay đổi của mRNA (tỉ lệ mRNA giữa 2 quần thể), do đó nó cũng có thể phát hiện mRNA mới. ?Tuy nhiên, vì nó chỉ cho biết tỉ lệ giữa hai mức độ mRNA, tỉ lệ này phải thật là cao mới có thể gợi ý là một mRNA mới đã xuất hiện. ?Duy đã nói là nó không thể và tôi muốn đính chính lại chổ này.

Thực ra tôi mới tìm được câu trả lời qua các tài liệu mà Cường đã cung cấp:

Suppression Subtractive Hybridization (SSH) is a powerful technique to identify a set of genes differentially expressed in two cell samples in the absence of sequence information.
http://hugroup.cems.umn.edu/Research/genomics/ssh.htm

pp SSH mạnh hơn microarray ở một chổ là nó có thể dùng cho những loài chưa có thông tin về trình tự bộ gene. ?Còn microarray thì cần biết thông tin này để in lên array.


Còn một câu rất hay mà Cường đã đưa ra:

Như đã nói ở trên, có 3 khả năng cần được phát hiện:
(1)- Xuất hiện cDNA mới
(2)- Mất đi 1 cDNA vốn có
(3)- Tăng / giảm số lượng bản sao
thì với SSH tôi mới chỉ hiểu được ý thứ nhất, đó là xác định những đoạn cDNA mới. Tôi chưa dám kết luận SSH có thể làm được hay không làm được 2 việc 2 và 3, mong bạn nào có kinh nghiệm hơn về SSH giải đáp thắc mắc này.

Tôi nghĩ là SSH có thể làm số 1 và 2 nhưng không thể làm được số 3. ?Các bạn có giải thích được không qua sơ đồ minh họa mà Cường đưa lên?

Tôi đang học rất nhiều từ các bạn rồi đó! ?Các câu hỏi của Duy, Hưng và Cường rất hay đã làm tôi hiểu thêm về pp này.

 

[Dương Văn Cường]

Tôi nghĩ là SSH có thể làm số 1 và 2 nhưng không thể làm được số 3.  Các bạn có giải thích được không qua sơ đồ minh họa mà Cường đưa lên?

Vâng, cái số 2 chỉ cần lật ngược lại, dùng thể đột biến làm driver và dùng kiểu gene hoang dại làm tester.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

pp SSH mạnh hơn microarray ở một chổ là nó có thể dùng cho những loài chưa có thông tin về trình tự bộ gene. ?Còn microarray thì cần biết thông tin này để in lên array.

Có thể đây là câu trả lời.

Tôi nghĩ là SSH có thể làm số 1 và 2 nhưng không thể làm được số 3. ?Các bạn có giải thích được không qua sơ đồ minh họa mà Cường đưa lên?

Anh nghĩ sao nếu ta kết hợp SSH với real-time --> real-time SSH (như kiểu real-time PCR) để giúp giải quyết vấn đề (3)?