Câu hỏi về Miniprep

[Nguyễn Ngọc Lương]

Mình làm miniprep đã lâu, alkaline lysis lẫn Promega miniprep kit.
Có một vấn đề là thường khi nuôi vi khuẩn overnight, mình không để ý lắm đến OD, log phase, mà cứ tùy tiện thu tế bào khi nào cảm thấy tiện nhất.
Trong các protocol nó đều khuyến cáo seeding, rồi mới culture và thu tế bào ở OD khoảng 0.4, tức log phase.
Vậy mình muốn hỏi liệu thu ở giai đoạn OD cao hơn thì lượng plasmid có bị ảnh hưởng không và ảnh hưởng như thế nào? (ví dụ khi tế bào chết rồi thì đương nhiên plasmid cũng mất đi).
Có vẻ như high-copy plasmid thì không ảnh hưởng lắm. Bạn nào làm low-copy plasmid thì có làm đúng như protocol không?

 

[Cao Xuân Hiếu]

Em dùng miniprep kit của Fermentas để tách low-copy plasmid cho kết quả rất tốt mà ko cần phải seeding gì hết, lấy trực tiếp từ ovn culture thôi.

Về mặt nguyên lý, lấy tế bào ở pha stationary sẽ có nhiều xác tế bào, trong đó DNA chromosome của vi khuẩn có thể bị phân mảnh. Những đoạn này dễ lẫn tạp với DNA plasmid khi tách pp = alkaline/SDS.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Cám ơn Hiếu. Nhưng mà mình đang làm việc với fosmid, kích thước 40 kbp và cũng low-copy, nên sau khi miniprep thấy không ra được bao nhiêu. Không biết do hiệu suất thu hồi thấp, hay do thu tế bào ở giai đoạn trễ quá.
Hôm trước có đứa nó bày cho cách rất hay để elution plasmid lớn hơn 20 kbp (size limit của plasmid dùng trong miniprep cột):
+ cắt miếng gel chứa band của mình.
+ cho vào 1 ống thẩm tích cutoff 6000-8000 Dal
+ cho 1 ít TE buffer vào rồi dùng kẹp kẹp chặt 2 đầu của ống thẩm tích
+ nhúng vào tank cho chạy khoảng 5 phút sao cho band nó tuột khỏi gel (kiểm tra trên đèn UV)
+ lấy dịch TE trong ống thẩm tích đi tách phenol rồi tủa bằng cồn.

 

[Cao Xuân Hiếu]

hi anh Lương, em cũng đang thường xuyên phải tách BAC (insert size ~ 100kb) nhưng ko thể làm ở miniprep vì lượng thấp quá mà phải scale up lên 200mL dịch nuôi và tách = kit midiprep. Nói chung khi tách plasmid có kích thước lớn + với low copy number thì khá stricky bởi cái nguyên tắc alkaline/SDS ko thực sự tốt để phân tách plasmid đó với DNA chromosome. E chỉ suggest là nên dùng midiprep với loại plasmid đó. Còn nếu là low copy plasmid với insert size không quá lớn thì miniprep kit của Fermentas là tốt cả về hiệu suất và giá cả.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Cám ơn Hiếu. Khả năng mua Midiprep kit là rất thấp vì kiểm tra thấy giá mắc quá. Nhưng mà để thương lượng với GS xem sao, bởi vì mục đích của tách plasmid này là để chromosomal walking. Để thử alkaline lysis large scale nếu mà không được nữa thì đành mua Midiprep vậy.

À. Mà hôm trước làm large scale theo kiểu nửa kit nửa manual: làm theo kit cho đến đoạn cho neutralizing buffer vào rồi ly tâm thu dịch nổi. Dịch nổi này đem chiết phenol 1 lần rồi đem đi tủa bằng EtOH với 10% NaOAc. Khi ly tâm thấy có pellet to, vậy mà chả hiểu sao khi kiểm tra trên gel lại không có plasmid. Rất quái.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Co phai anh tua EthOH -20oC/-80oC ? Tua ma mau trang tinh la de lan nhieu salt. Bt em tua Isopropanol RT nhung ly tam o 4oC 30min thi thay tot. Em cung da thu tach miniprep manually thi fai chap nhan tua Isopropanol o -80oC 15min. Luc do pellet nhin trang va luong DNA thu dc co the dung de lam template cho PCR (pha loang 25x).

 

[Biologist]

Mình làm miniprep đã lâu, alkaline lysis lẫn Promega miniprep kit.
Có một vấn đề là thường khi nuôi vi khuẩn overnight, mình không để ý lắm đến OD, log phase, mà cứ tùy tiện thu tế bào khi nào cảm thấy tiện nhất.
Trong các protocol nó đều khuyến cáo seeding, rồi mới culture và thu tế bào ở OD khoảng 0.4, tức log phase.
Vậy mình muốn hỏi liệu thu ở giai đoạn OD cao hơn thì lượng plasmid có bị ảnh hưởng không và ảnh hưởng như thế nào? (ví dụ khi tế bào chết rồi thì đương nhiên plasmid cũng mất đi).
Có vẻ như high-copy plasmid thì không ảnh hưởng lắm. Bạn nào làm low-copy plasmid thì có làm đúng như protocol không?

Lương:
Lương nên làm theo protocol chỉ dẫn. Không nên overgrow E. coli, bởi vì ở stationary phase, E. coli sẽ tổng hợp nhiều polysaccharides và đôi khi sẽ "release chromosomal DNA". Cả hai thứ này đều sẽ kết tủa cùng với plasmid DNA (có lẽ do vậy mà Lương thấy có pellet to nhung thuc ra pellet của Lương không chứa nhiều plasmid DNA. Polysaccharides sẽ inhibit restriction digestion" và "sequencing reaction".
Dùng 0.6V isopropanol thì pellet sẽ sạch hơn so với khi dùng 2V ethanol. Tuy vậy, cả hai loại alcohol này đều kết tủa polysaccharides.

Chúc thành công,


David-

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Khi tủa RNA hoặc DNA, lắm khi người ta bảo phải thêm muối vào (NaCl/NaOAc), đôi khi lại không thêm. Vậy thì đâu là đúng?
Hồi trước làm RNA của nấm men, có dạo ly tâm 30 phút 13000 rpm là được cục pellet to tướng. Có dạo nó lại rã ra từng mảnh rồi bám vào thành của EP tube. Không hiểu lý do làm sao. Tăng lên 15000 rpm thì lại được cục pellet to tướng ở đáy EP tube trở lại.

 

[Biologist]

Khi tủa RNA hoặc DNA, lắm khi người ta bảo phải thêm muối vào (NaCl/NaOAc), đôi khi lại không thêm. Vậy thì đâu là đúng?
Hồi trước làm RNA của nấm men, có dạo ly tâm 30 phút 13000 rpm là được cục pellet to tướng. Có dạo nó lại rã ra từng mảnh rồi bám vào thành của EP tube. Không hiểu lý do làm sao. Tăng lên 15000 rpm thì lại được cục pellet to tướng ở đáy EP tube trở lại.

Lương: Có rất nhiều bài viết về các lý do tại sao phải thêm Na salt trước khi thực hiện alcohol precipitation. Theo tôi hiểu thì high salt concentrations sẽ giúp DNA kết tủa dễ hơn, nhất là khi Bạn làm việc với low DNA concentration. Tuy vậy, sau khi kết tủa, thông thường thì Bạn phải wash DNA pellet voi 70% ethanol ít nhất là một lần để remove Na salt. Trong một vài trường hợp đặc biệt, Bạn có thể thấy các protocols suggest là Bạn phải wash DNA pellet voi 70% ethanol tới ba lần.
Khi DNA va RNA thật sự sạch, pellet sẽ không có màu trắng mà lại "transparent". Do vậy, khi Bạn thấy "huge" white pellet, rất có thể là DNA của Bạn còn lẫn nhiều salt từ extraction buffer.
Chính vì "clean" DNA không có màu (transparent) mà một số protocols lại suggest là Bạn phải add ~1 microliter of glycogen trước khi thực hiện ethanol precipitation. Lý do là glycogen là một polysaccharide, khi kết tủa cùng với DNA, glycogen sẽ làm cho pellet có màu trắng và giúp Bạn có thể nhìn thấy được DNA pellet (otherwise, you would think that the pellet has been gone!).

Chuc thanh cong!

Trong trường hop này, câu châm ngôn của Bạn "Molecular biology is deceptively simple. Method is everything but the devil is in the detail" co the duoc ap dung.

 

[Ho Huu Tho]

Khi tủa RNA hoặc DNA, lắm khi người ta bảo phải thêm muối vào (NaCl/NaOAc), đôi khi lại không thêm. Vậy thì đâu là đúng?

Theo em tham khảo ở bài này thì ion dương là để tạo liên kết ion với gốc phốt phát của axit nucleic, nhờ đó mới kết tủa được. Việc thêm muối hay không theo em là tùy thuộc vào lượng ion dương hiện có trong dung dịch tách chiết là bao nhiêu, nếu đã có đủ rồi thì không cần cho thêm.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Haizz. Đúng là "devil is in the detail" thật. Nhiều khi có những cái không thể giải thích được. Có lẽ trong SHPT, sống càng lâu thì tích lũy được nhiều cái details nhỉ
Hôm nọ xem cái E.coli expression của 1 thằng bạn. Thấy cục protein to đùng nằm sai vị trí (ở mẫu có induction), nó cứ băn khoăn tại sao. Thử qua cột Ni-NTA agarose cái hóa ra thằng đấy là thằng nào chứ không phải protein của mình. Còn protein biểu hiện thì có chút xíu, gần như không phân biệt được với mẫu không inuduction.
Hồi xưa để hòa tan cục RNA pellet, em cũng chẳng biết làm thế nào. Vì được khoảng 15 phút sau khi cho DEPC treated H2O vào là pellet nó vón cục lại như cục gel. Tìm đọc mãi chả thấy ai giải thích. Cuối cùng cho thêm ít DEPC treated H2O vào và để mẫu trong đá tầm 1-2 tiếng cho pellet nó rã dần ra, rồi lấy pipette đem giã cục gel đó ra, flipping thêm mấy phát, thế là thu được toàn bộ RNA vào DEPC.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Cám ơn Hiếu. Khả năng mua Midiprep kit là rất thấp vì kiểm tra thấy giá mắc quá. Nhưng mà để thương lượng với GS xem sao, bởi vì mục đích của tách plasmid này là để chromosomal walking. Để thử alkaline lysis large scale nếu mà không được nữa thì đành mua Midiprep vậy.

À. Mà hôm trước làm large scale theo kiểu nửa kit nửa manual: làm theo kit cho đến đoạn cho neutralizing buffer vào rồi ly tâm thu dịch nổi. Dịch nổi này đem chiết phenol 1 lần rồi đem đi tủa bằng EtOH với 10% NaOAc. Khi ly tâm thấy có pellet to, vậy mà chả hiểu sao khi kiểm tra trên gel lại không có plasmid. Rất quái.

Anh tối ưu quy trình này như thế nào rồi? Giờ em cũng phải giải bài toán tương tự: dùng miniprep kit để tách hỗn hợp BAC sao cho ko chỉ đủ lượng mà tính đại diện của các mẫu cũng phải giữ nguyên.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Với lượng nhỏ thì cứ làm theo protocol, nhưng dồn 2-3 EP tubes lại cho 1 cột, và elution buffer thì làm ấm ở 65 độ C.
Với quy mô vừa thì midiprep như sau (theo molecular cloning)

Có điều không được sạch RNA lắm.

1st seed: 50 ml trong flask 300 ml ON
Culture 500 ml 16 tiếng
Ly tâm 4500 rpm thu tế bào
Để ngược cho ráo môi trường. Cho 100 ml STET vào đánh tan tế bào
Ly tâm thu tế bào và cất ở -20 trong 1 tiếng đến ON
Làm midiprep cho mẫu này (SolI, SolII, SolIII)
Tủa lysate bằng isopropanol 60%. Để 1 tiếng ở RT cho nó lắng xuống rồi đổ bớt supernatant đi để ly tâm
Rửa pellet bằng 70% EtOH
Úp ngược tube cho nó ráo EtOH rồi để phơi khô ở RT khoảng >1 h
Hòa tan bằng 3 ml dH2O
Ly tâm loại cặn và thu lấy dịch nổi.
Xử lý bằng RNase (khảo sát thời gian kẻo nó digest luôn DNA).
Loại RNase bằng Phenol:chloroform extraction.

Với 500 ml thì đủ mẫu để làm khoảng mười mấy pứ primer walking 2 chiều (~ >10kbp)

 

[Cao Xuân Hiếu]

Với lượng nhỏ thì cứ làm theo protocol, nhưng dồn 2-3 EP tubes lại cho 1 cột, và elution buffer thì làm ấm ở 65 độ C.

Em quan tâm đến lượng nhỏ, làm thế nào tách được chỉ với ít hơn 20mL ovn cultures, trong khi BAC plasmid có tầm 100kb. Anh có những mẹo gì đặc biệt k?

Em đang thử 1 vài chiến thuật và tập hợp tại

Thành viên:Cao Xuân Hiếu/Note: Tách BAC DNA từ GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit‎;

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

20 ml chắc tách đủ cho khoảng 50 ul plasmid. Fosmid của mình không biết size bao nhiêu vì nó trên cả 22 kbp của lamda ladder nhưng tách kiểu miniprep kit này thấy lượng cũng ổn. Đủ làm việc với một số phân tích như PCR, Southern...v.v.
Thấy cái duy nhất khác với miniprep thông thường là làm ấm elution buffer lên 65 độ. Và tập hợp 2-3 clear lysate lại (sau khi đã cho neutralizing buffer vào và ly tâm) vào 1 column. Không rõ hiệu suất elution có ảnh hưởng khi plasmid lớn như vậy không nữa. Thường thì chỉ có gel elution kit nó mới đề cập size limit chứ không thấy đề cập size limit ở miniprep.