Hình ảnh điện di !

[Nguyễn Quang Hưng]

Chào các bạn trong diễn đàn, mình có gặp một vấn đề trong quá trình làm thí nghiệm mong các bạn giải thích giúp nhé. Mình dùng Agarose 1.1% điện di DNA trong khoảng 15 phút, kiểm tra kết quả thấy vệt sáng ở vạch 100 hoặc 200 bp, nhưng nếu điện di tiếp khoảng 10 phút nữa thì vệt sáng đó lại chạy dài theo hướng ngược lên trên là sao vậy ?. Thanks !

 

[Ho Huu Tho]

Chào các bạn trong diễn đàn, mình có gặp một vấn đề trong quá trình làm thí nghiệm mong các bạn giải thích giúp nhé. Mình dùng Agarose 1.1% điện di DNA trong khoảng 15 phút, kiểm tra kết quả thấy vệt sáng ở vạch 100 hoặc 200 bp, nhưng nếu điện di tiếp khoảng 10 phút nữa thì vệt sáng đó lại chạy dài theo hướng ngược lên trên là sao vậy ?. Thanks !

Mẫu ADN điện di của bạn có xuất xứ thế nào, bạn nhuộm bằng phương pháp gì và chạy dài theo hướng ngược lên trên là so với cái gì?

 

[Nguyễn Quang Hưng]

Mẫu ADN điện di của bạn có xuất xứ thế nào, bạn nhuộm bằng phương pháp gì và chạy dài theo hướng ngược lên trên là so với cái gì?

Thanks bạn Thọ nhé !. mình diện di mẫu là DNA cây chè tách chiết và bảo quản từ năm trước, nhuộm màu bằng bromphenol blue, băng sáng chạy ngược lên trên phía giếng đó.

 

[Ho Huu Tho]

Thanks bạn Thọ nhé !. mình diện di mẫu là DNA cây chè tách chiết và bảo quản từ năm trước, nhuộm màu bằng bromphenol blue, băng sáng chạy ngược lên trên phía giếng đó.

Bromphenol blue mà bạn đề cập đến là đệm để load mẫu chứ đâu phải thuốc nhuộm nhỉ. Ý mình hỏi là băng sáng mà bạn quan sát thấy được sau khi bạn nhuộm bằng phương pháp gì?

 

[Hà Thị Minh Thi]

bạn Hưng có thể cho mọi người xem ảnh chụp kết quả thí nghiệm mà bạn hỏi đựơc không? nếu không có ảnh chụp thì nhờ bạn vẽ lại cũng được. Mình quan tâm đến câu hỏi của bạn. Thanks!

 

[Nguyễn Quang Hưng]

Bromphenol blue mà bạn đề cập đến là đệm để load mẫu chứ đâu phải thuốc nhuộm nhỉ. Ý mình hỏi là băng sáng mà bạn quan sát thấy được sau khi bạn nhuộm bằng phương pháp gì?

hi,mình không hiểu ý của bạn, khi nhuộm mẫu mình dùng bromphenol blue còn khi làm bản gell mình dùng ethidium bromide, bạn xem thêm ảnh điện di rồi cho mình xin ý kiến nhé. Thanks.

 

[Nguyễn Quang Hưng]

bạn Hưng có thể cho mọi người xem ảnh chụp kết quả thí nghiệm mà bạn hỏi đựơc không? nếu không có ảnh chụp thì nhờ bạn vẽ lại cũng được. Mình quan tâm đến câu hỏi của bạn. Thanks!

bạn xem ảnh điện di rồi góp ý cho mình nhé. hình 1 sau điện di 15', hình 2 sau điện di 20', hình 3 sau điện di 25'. mình nghĩ có thể mẫu điện di bị nhiễm nhưng thắc mắc là tại sao băng sáng lại chạy ngược về phía giếng. thanks.

 

[Ho Huu Tho]

Bạn thử đo nồng độ ADN bằng máy Nanodrop xem độ tinh sạch của mẫu ADN này thế nào? Mình nghĩ vệt smear đó không phải là ADN. Nếu độ tinh sạch của mẫu không đảm bảo thì bạn thử tinh sạch lại và chạy điện di lại xem kết quả có khác không.

 

[voh5]

Bạn thử đo nồng độ ADN bằng máy Nanodrop xem độ tinh sạch của mẫu ADN này thế nào? Mình nghĩ vệt smear đó không phải là ADN. Nếu độ tinh sạch của mẫu không đảm bảo thì bạn thử tinh sạch lại và chạy điện di lại xem kết quả có khác không.

Gọi là đo nồng độ ADN trên máy quang phổ thôi bác, chứ Nanodrop chỗ bác có, chỗ người ta không có thì láy gì mà đo bác nhở!

 

[voh5]

Thanks bạn Thọ nhé !. mình diện di mẫu là DNA cây chè tách chiết và bảo quản từ năm trước, nhuộm màu bằng bromphenol blue, băng sáng chạy ngược lên trên phía giếng đó.

Góp ý tí ti với bác Hưng, từ kinh nghiệm em đã từng làm với ADN thực vật, là mẫu ADN tách chiết từ thực vật bảo quản chẳng được bao lâu. Trước em cũng từng làm với mẫu ADN tách chiết từ cây chè (trong một đề tài của các thầy ở BM Hóa sinh - Khoa sinh - ĐH KHTN HN) bằng bộ kit DNA Easy Plant hẳn hoi, nhưng chỉ được tầm 3 tháng, sủ dụng lại để làm PCR thì toàn không được, điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết thì toàn được ảnh như ảnh thứ 3 của bác attached lên ấy (lưu ý nữa là cả bảo quản trong H2O (ultrapure hẳn hoi nhé) lẫn trong EDTA cũng thế. Đã thử tìm hiểu nhưng không hiểu nguyên nhân lắm, với lại cũng kô phải cái của mình làm nên bỏ qua ngay (giờ mới nhớ lại với thời gian từ 2004).

Với các băng điện di của bác Hưng gửi, thì bản thân em thấy chẳng có gì phải bàn cả. Ở đây là điện di ADN tổng số, chứ không phải là điện di sản phẩm PCR, nên trường hợp ADN còn treo trên giếng là bình thường, sau điện di ơ thời gian dài hơn thì có thể các đoạn ở trên chạy xuống thôi! Em không lý giải thêm vệt smear như thế nào, thiết nghĩ của em là trong hỗn hợp tách chiết ADN từ chè của anh có lẫn Protein hay gì gì đấy có thể ngăn cản các đoạn ADN lớn xuống chậm hơn.

Ý kiến của em về ảnh điện di của bác: Có acide nucleic, nồng độ: Không xác định, có thể sử dụng cho các phản ứng PCR, nhưng nếu để okie hơn thì nên tách chiết lại. Bác tham khảo cái đoạn đầu tiên của em để kiểm chứng xem trên bác có bị thế không nhé.

PS: Bacs Hưng này làm ở NOMAFSI có cùng bộ môn anh Thiệp không?

 

[Nguyễn Quang Hưng]

Góp ý tí ti với bác Hưng, từ kinh nghiệm em đã từng làm với ADN thực vật, là mẫu ADN tách chiết từ thực vật bảo quản chẳng được bao lâu. Trước em cũng từng làm với mẫu ADN tách chiết từ cây chè (trong một đề tài của các thầy ở BM Hóa sinh - Khoa sinh - ĐH KHTN HN) bằng bộ kit DNA Easy Plant hẳn hoi, nhưng chỉ được tầm 3 tháng, sủ dụng lại để làm PCR thì toàn không được, điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết thì toàn được ảnh như ảnh thứ 3 của bác attached lên ấy (lưu ý nữa là cả bảo quản trong H2O (ultrapure hẳn hoi nhé) lẫn trong EDTA cũng thế. Đã thử tìm hiểu nhưng không hiểu nguyên nhân lắm, với lại cũng kô phải cái của mình làm nên bỏ qua ngay (giờ mới nhớ lại với thời gian từ 2004).

Với các băng điện di của bác Hưng gửi, thì bản thân em thấy chẳng có gì phải bàn cả. Ở đây là điện di ADN tổng số, chứ không phải là điện di sản phẩm PCR, nên trường hợp ADN còn treo trên giếng là bình thường, sau điện di ơ thời gian dài hơn thì có thể các đoạn ở trên chạy xuống thôi! Em không lý giải thêm vệt smear như thế nào, thiết nghĩ của em là trong hỗn hợp tách chiết ADN từ chè của anh có lẫn Protein hay gì gì đấy có thể ngăn cản các đoạn ADN lớn xuống chậm hơn.

Ý kiến của em về ảnh điện di của bác: Có acide nucleic, nồng độ: Không xác định, có thể sử dụng cho các phản ứng PCR, nhưng nếu để okie hơn thì nên tách chiết lại. Bác tham khảo cái đoạn đầu tiên của em để kiểm chứng xem trên bác có bị thế không nhé.

PS: Bacs Hưng này làm ở NOMAFSI có cùng bộ môn anh Thiệp không?

Cảm ơn bạn Thọ và bạn voh 5 nhe !. Đúng là ở phòng thí nghiệm của mình không có máy nanodrop. một phần vì không được học chuyên về sinh học phân tử,không có kinh nghiệm cả về lý thuyết lẫn kinh nghiệm thực tế, hơn nữa phòng thí nghiệm của mình lại mới thành lập lên không có ai là sư phụ để hỏi cả, thế nên công việc tự mày mò là chính. Không biết mọi người tuổi tác thế nào lên gọi là bạn, có gì thất lễ xin được đáp lễ sau nhé.
Về mẫu DNA bảo quản từ năm trước có lẽ không ổn, nhưng do thày giáo nói có thể sử dụng được lên minh lấy dùng(thày giáo cũng không chuyên), mình sẽ tách triết mẫu mới.
Hình ảnh điện di trên không phải là điện di DNA tổng số như voh5 nói mà là sản phẩm PCR. Rõ ràng băng sáng không phải là từ trên chạy xuống(do DNA còn cheo ở giếng chạy xuống thì có thể giải thích được) mà là từ dưới chạy ngược lên nên không biết giải thích nó như thế nào ?
Mình làm ở chỗ X Thiệp, voh5 biết X Thiệp ah. Có dịp gặp nhau thì hay nhỉ !
Cảm ơn và xin ý kiền của các bạn nhé !.

 

[Nguyễn Xuân Trường]

cái ảnh thứ 3 có thể do khi điện di tiếp để ngược cực âm thành dương làm cho băng chạy ngược lại, thấy khoảng cách của marker giảm so với cái ảnh thứ 2. Do các băng sản phẩm PCR kích thước nhỏ nên chạy về giếng nhanh hơn so với marker tạo ra vệt smear. Không biết giả thiết này có đúng không???

 

[voh5]

cái ảnh thứ 3 có thể do khi điện di tiếp để ngược cực âm thành dương làm cho băng chạy ngược lại, thấy khoảng cách của marker giảm so với cái ảnh thứ 2. Do các băng sản phẩm PCR kích thước nhỏ nên chạy về giếng nhanh hơn so với marker tạo ra vệt smear. Không biết giả thiết này có đúng không???

Ý kiến chủ quan của mình thì thấy ý này của bạn không chính xác lắm. Nếu quay lại nhìn ảnh các bản gel điện di thì thấy riêng với land của marker: Băng ngày càng sắc nét hơn, phân tách xa nhau hơn, băng kích thước cao nhất ngày càng rõ và xa với giếng điện di đấy chứ.

Thực sự có một kinh-nghiêm-thực-tế như đã nói ở trên khi tách chiết ADN tổng số từ lá chè, ở đây là em làm thí nghiệm với mẫu lá chè trong đề tài nào đó thầy Mùi - Khoa Hóa sinh - HUS từ những năm cuối 2003 - 2004. Các ACE nào đã từng làm thí nghiệm tách chiết ADN từ thực vật, đặc biệt là lá chè (chắc có nhiều tanin) thì cho ý kiến nhé!

Đúng là ở phòng thí nghiệm của mình không có máy nanodrop.

Hình ảnh điện di trên không phải là điện di DNA tổng số như voh5 nói mà là sản phẩm PCR. Rõ ràng băng sáng không phải là từ trên chạy xuống(do DNA còn cheo ở giếng chạy xuống thì có thể giải thích được) mà là từ dưới chạy ngược lên nên không biết giải thích nó như thế nào ?
Mình làm ở chỗ X Thiệp, voh5 biết X Thiệp ah. Có dịp gặp nhau thì hay nhỉ !
Cảm ơn và xin ý kiền của các bạn nhé !.

+ Trên bác không có máy NanoDrop, nhưng có máy quang phổ đấy. Bác hỏi lại anh Thiệp mà xem, và theo em, dùng máy Quang phổ cũng chẳng tốn kém hư hại gì (trừ trường hợp phải in), nên bác cứ nghịch thử thoải mái.
+ Bác không nói từ đầu là điện di PCR (mà nói ADN là ADN tổng số ^_^). Em thì biện luận gì, em theo cái chuẩn nhất (marker), nên theo em mọi thứ đều OK đối với máy điện di, buffer và thao tác điện di. Chỉ là chưa nghĩ ra câu trả lời nào thỏa đáng cho trường hợp của bác... Hôm nay chắc cần lục lại cái đống sổ thí nghiệm từ 2003 xem có note gì từ ngày xưa không...

 

[Nguyễn Quang Hưng]

cái ảnh thứ 3 có thể do khi điện di tiếp để ngược cực âm thành dương làm cho băng chạy ngược lại, thấy khoảng cách của marker giảm so với cái ảnh thứ 2. Do các băng sản phẩm PCR kích thước nhỏ nên chạy về giếng nhanh hơn so với marker tạo ra vệt smear. Không biết giả thiết này có đúng không???

Hi, cái này thì chắc không nhầm đươc đâu, vì mình làm nhiều lần bị như thế rồi mà.

 

[Ho Huu Tho]

Hi, cái này thì chắc không nhầm đươc đâu, vì mình làm nhiều lần bị như thế rồi mà.

Bạn có thể cung cấp các ảnh gel gốc chưa cắt dán được không, như thế thì mới dễ so sánh các khoảng cách ở các gel ở các thời điểm khác nhau.
Vì mẫu ADN của bạn là sản phẩm PCR nên việc đo phổ không có ý nghĩa nếu bạn chưa tinh sạch để loại bỏ mồi và nucleotide thừa sau phản ứng.

 

[Nguyễn Quang Hưng]

Bạn có thể cung cấp các ảnh gel gốc chưa cắt dán được không, như thế thì mới dễ so sánh các khoảng cách ở các gel ở các thời điểm khác nhau.
Vì mẫu ADN của bạn là sản phẩm PCR nên việc đo phổ không có ý nghĩa nếu bạn chưa tinh sạch để loại bỏ mồi và nucleotide thừa sau phản ứng.

Hi, bản gốc của lần chạy điện di đó do mình làm trước khi nghỉ hè khi quay lại phòng thí nghiệm thì bị virút mất rồi. cái này mình mới làm cũng hiện tượng như thế.

Ở ảnh thứ 2 điểm cuối của các giếng đều ở vạch 100bp, nhưng ở ảnh thứ 3 điểm cuối các giếng đều ở trên vạch 250bp và phân tán ngược làm mờ nhạt các băng. rõ nhất là ở giếng thứ 3 từ trái sang.

Mình nghĩ không biết có phải do tốc độ các băng của marker chậm hơn tốc độ các băng DNA không nhỉ ?

 

[Ho Huu Tho]

Hi, bản gốc của lần chạy điện di đó do mình làm trước khi nghỉ hè khi quay lại phòng thí nghiệm thì bị virút mất rồi. cái này mình mới làm cũng hiện tượng như thế.

Ở ảnh thứ 2 điểm cuối của các giếng đều ở vạch 100bp, nhưng ở ảnh thứ 3 điểm cuối các giếng đều ở trên vạch 250bp và phân tán ngược làm mờ nhạt các băng. rõ nhất là ở giếng thứ 3 từ trái sang.

Mình nghĩ không biết có phải do tốc độ các băng của marker chậm hơn tốc độ các băng DNA không nhỉ ?

Với ảnh điện di này thì mình thấy sự di chuyển của các vệt sáng đều không có gì đặc biệt: càng ngày càng xa giếng điện di.
Về nhận xét của bạn Hưng trong phần in đậm về sự không tương ứng giữa tốc độ di chuyển của mẫu ADN của bạn so với ladder, theo mình lý do có thể giải thích việc này là: Sản phẩm PCR của bạn sau một thời gian dài bảo quản có thể bị đứt gãy thành các mảnh có kích thước nhỏ hơn, độ dài thực tế của các phân tử ADN mà bạn muốn kiểm tra dao động trong một khoảng nhất định. Các ảnh điện di mà bạn cung cấp đã minh họa cho điều này:
- Theo ảnh điện di thời điểm đầu tiên thì đoạn có độ dài lớn nhất có kích thước > kích thước của vạch thứ 3 từ dưới lên của ladder. Kích thước này theo suy luận của tôi chính là kích thước của sản phẩm PCR ban đầu.
- Cũng theo ảnh điện di này thì đoạn có độ dài bé nhất có kích thước vào khoảng nhỏ hơn 100 bp.
- Mẫu ADN của bạn gồm các đoạn có kích thước khác nhau nên khi điện di trong thời gian dài hơn (ảnh 2 và 3) thì các đoạn sẽ phân tách nhau ra dẫn đến đậm độ trên ảnh gel sẽ giảm. Những đoạn có kích thước lớn nhất và nhỏ nhất do có nồng độ thấp nhất (quy luật phân bố của xác suất) nên sẽ có đậm độ thấp nhất, những đoạn có kích thước trung bình sẽ có nồng độ cao nhất nên sẽ có đậm độ cao nhất ở trên ảnh gel.
- Những đoạn kích thước lớn nhất và nhỏ nhất với nồng độ nhỏ nhất khi được phân tách đủ lâu thì sẽ đến lúc không thấy gì trên ảnh gel nữa là có thể suy luận được: đơn giản là vì dưới ngưỡng phát hiện của nó (nhuộm ethidium bromide được cho là có độ nhạy thấp). Chính lý do này làm bạn không nhìn thấy những đoạn có kích thước nhỏ nhất ở ảnh gel 2 và 3 (mà bạn cho là những đoạn kích thước nhỏ đã di chuyển lên trên so với ladder).
- Phù hợp với nhận định này, bạn để ý thấy là kích thước của trung tâm phần sáng nhất (tương ứng với các đoạn có kích thước trung bình, nồng độ lớn nhất) di chuyển tương ứng với ladder.
- Bạn cũng lưu ý thêm là ảnh gel các lần chụp khác nhau của bạn có tín hiệu nền không giống nhau (tín hiệu nền ở ảnh 1 trắng nhất), nên việc so sánh ảnh gel chụp được ở các thời điểm khác nhau bị hạn chế. Bởi vì, ngay cùng một bản gel và một thời điểm điện di khi chụp với các chế độ tín hiệu nền khác nhau sẽ cho ra các hình ảnh băng sáng của mẫu ADN khác nhau.

Tôi không biết mục đích của bạn trong thí nghiệm trên, nhưng theo tôi có thể kết luận là có sản phẩm PCR với kích thước > vạch thứ 3 của ladder và sản phẩm PCR bị đứt gãy một phần nhất định sau thời gian bảo quản. Để kiểm tra điều này có thể chạy lại PCR với sản phẩm PCR này sau khi pha loãng.

 

[Nguyễn Quang Hưng]

Với ảnh điện di này thì mình thấy sự di chuyển của các vệt sáng đều không có gì đặc biệt: càng ngày càng xa giếng điện di.
Về nhận xét của bạn Hưng trong phần in đậm về sự không tương ứng giữa tốc độ di chuyển của mẫu ADN của bạn so với ladder, theo mình lý do có thể giải thích việc này là: Sản phẩm PCR của bạn sau một thời gian dài bảo quản có thể bị đứt gãy thành các mảnh có kích thước nhỏ hơn, độ dài thực tế của các phân tử ADN mà bạn muốn kiểm tra dao động trong một khoảng nhất định. Các ảnh điện di mà bạn cung cấp đã minh họa cho điều này:
- Theo ảnh điện di thời điểm đầu tiên thì đoạn có độ dài lớn nhất có kích thước > kích thước của vạch thứ 3 từ dưới lên của ladder. Kích thước này theo suy luận của tôi chính là kích thước của sản phẩm PCR ban đầu.
- Cũng theo ảnh điện di này thì đoạn có độ dài bé nhất có kích thước vào khoảng nhỏ hơn 100 bp.
- Mẫu ADN của bạn gồm các đoạn có kích thước khác nhau nên khi điện di trong thời gian dài hơn (ảnh 2 và 3) thì các đoạn sẽ phân tách nhau ra dẫn đến đậm độ trên ảnh gel sẽ giảm. Những đoạn có kích thước lớn nhất và nhỏ nhất do có nồng độ thấp nhất (quy luật phân bố của xác suất) nên sẽ có đậm độ thấp nhất, những đoạn có kích thước trung bình sẽ có nồng độ cao nhất nên sẽ có đậm độ cao nhất ở trên ảnh gel.
- Những đoạn kích thước lớn nhất và nhỏ nhất với nồng độ nhỏ nhất khi được phân tách đủ lâu thì sẽ đến lúc không thấy gì trên ảnh gel nữa là có thể suy luận được: đơn giản là vì dưới ngưỡng phát hiện của nó (nhuộm ethidium bromide được cho là có độ nhạy thấp). Chính lý do này làm bạn không nhìn thấy những đoạn có kích thước nhỏ nhất ở ảnh gel 2 và 3 (mà bạn cho là những đoạn kích thước nhỏ đã di chuyển lên trên so với ladder).
- Phù hợp với nhận định này, bạn để ý thấy là kích thước của trung tâm phần sáng nhất (tương ứng với các đoạn có kích thước trung bình, nồng độ lớn nhất) di chuyển tương ứng với ladder.
- Bạn cũng lưu ý thêm là ảnh gel các lần chụp khác nhau của bạn có tín hiệu nền không giống nhau (tín hiệu nền ở ảnh 1 trắng nhất), nên việc so sánh ảnh gel chụp được ở các thời điểm khác nhau bị hạn chế. Bởi vì, ngay cùng một bản gel và một thời điểm điện di khi chụp với các chế độ tín hiệu nền khác nhau sẽ cho ra các hình ảnh băng sáng của mẫu ADN khác nhau.

Tôi không biết mục đích của bạn trong thí nghiệm trên, nhưng theo tôi có thể kết luận là có sản phẩm PCR với kích thước > vạch thứ 3 của ladder và sản phẩm PCR bị đứt gãy một phần nhất định sau thời gian bảo quản. Để kiểm tra điều này có thể chạy lại PCR với sản phẩm PCR này sau khi pha loãng.

Cảm ơn bạn Thọ về những nhận xét trên nhé. Mình dùng thước đo thủ công các ảnh điện di cũng thấy các băng sáng di chuyển xa hơn so với giếng ban đầu chứ không phải di chuyển ngược lên theo ý kiến ban đầu của mình. mình nghĩ có lẽ do sản phẩm PCR bị đứt gãy như bạn nói sau thời gian bảo quản và cũng có thể do chất lượng DNA ban đầu không tốt dẫn đến sản phẩm PCR không đồng nhất. mình sẽ làm lại thí nghiệm này.

 

[Cao Xuân Hiếu]

neu nhan PCR = 1 cap moi dac hieu thi du chat luong DNA template co nhu the nao thi cung khong lam san pham PCR ko dong nhat duoc. Lay thang PCR day lam template roi nhan tiep = cap primer cu hoac nest PCR thi se co ket luan chinh xac hon.

 

[Nguyễn Quang Hưng]

Lay thang PCR day lam template roi nhan tiep = cap primer cu hoac nest PCR thi se co ket luan chinh xac hon.

Thanks bạn Hiếu nhé, có phải ý bạn nói lấy sản phẩm p/ư PCR đó làm vật liệu rồi tiếp tục chạy tiếp PCR lần nữa không. cái này mình cũng thử làm rồi, có phản ứng cho kết quả tốt hơn cho hình ảnh băng sáng rõ lét hơn nhưng cũng có phản ứng cho kết quả không tốt bằng kq chỉ chạy PCR một lần. Có ai đã làm và gặp như thế chưa nhỉ, giải thích giúp mình nhé !