Hiệu suất cắt của các enzym giới hạn?

[ngaytho]

Em đang thiết kế quy trình PCR cloning, cày cục mãi mới thiết kế được mồi có chèn đoạn giới hạn. Hic, nhưng làm xong rồi thì supervisor của em bảo enzym em dùng này có hiệu suất cắt không cao. Em dùng Afl II ạ. Tiện thể cho em hỏi với Pme I thì thế nào? Cảm ơn các bác trước nhé!

 

[Dương Văn Cường]

Thường thì hiệu suất digest của RE chỉ bị quan tâm khi làm double digestion vì khi đó phải chọn buffer cũng như nhiệt độ tối ưu cho cả 2 enzymes.

Nếu cắt single với mục đích cloning thì enzyme nào cũng được cả, cứ đúng manual mà phang.

Cụ thể PmeI thì ở đây:

http://www.neb.com/nebecomm/products/productR0560.asp

Concentration: 10,000 units/ml

Four units of PmeI are required for complete digestion of 1 µg of pNEB193.

Enzyme này cắt đầu bằng theo mình không phải là lựa chọn hợp lý với mục đích ligate vào vector.

 

[ngaytho]

Em cảm ơn bác Cường nhìu lắm lắm. Hôm nay supervisor của em cũng phải chịu em rồi. Hìhhiiii

 

[Mitita]

Em dùng HindIII và EcoRI để cắt pEGFP-C3 và pcDNA3. Cắt bằng buffer M của Takara, dùng 1 microL enz, tổng thể tích cắt là 20 microL, để trong 1 tiếng. Vậy mà ligate và biến nạp thì vẫn thấy plasmid tự nối. Em có nên để thời gian lâu hơn không?
Anh chị nào giúp em với, em xin cảm ơn ạ!

 

[Mitita]

Hôm qua em để cắt 6 tiếng, hai plasmid thì cho 1 band duy nhất, còn insert thì không thấy đâu, haizz

 

[Dương Văn Cường]

Hi Mitita,

Anh vừa check ở đây với HindIII và EcoRI thì ra cái này:

Double digest is not recommended. A sequential digest is required, using each enzyme in its supplied NEBuffer.

Mặc dù cả 2 enzyme này đều có hoạt tính 100% khi dùng NEB buffer 2 nhưng họ vẫn recommend là cắt lần lượt.

Chịu khó làm lại thôi thanh niên!