Nguyễn Quang Hưng
Senior Member
Chào các Bác. Các Bác cho E xin ít kinh nghiệm về thiết kế Primer nhé. thanks các Bác nhiếu !
Thiết kế Primer !
- Thread starter Nguyễn Quang Hưng
- Start date
Ho Huu Tho
Senior Member
Biết cho bạn cái kinh nghiệm nào bây giờ nếu bạn không nêu cụ thể hơn về trường hợp của bạn.
???:
)
Ho Huu Tho
Senior Member
Vì muốn tăng nhiệt độ gắn mồi nên mình dự định sẽ tăng chiều dài của primer lên 26 nucleotide. Không biết khi chiều dài của mồi như vậy thì có ảnh hưởng gì bất lợi cho phản ứng PCR không. Bạn nào có kinh nghiệm về cái này cho mình ý kiến với nhé. Xin cảm ơn trước.
Hà Thị Minh Thi
Senior Member
Mình đã làm với primer dài 26 nucleotide rồi, nhiệt độ gắn mồi trên 60oC, phản ứng của mình vẫn bình thường. Theo mình nhớ thì mồi có thể dài đến 30 nucleotide.
voh5
Senior Member
còn theo em nhớ, thì em đã từng chạy với mồi dài tới 46 nu rồi các bác ạ!
Mới lại, toàn thấy các bác làm loãng topic! Cứ mở topic hỏi mọi người vấn đề của mình rồi lại copy/paste lung tung để hỏi tiếp!
Anh Hưng định thiết kế primer như thế nào thế?
Ho Huu Tho
Senior Member
Cảm ơn voh5 đã chia sẻ kinh nghiệm hay nhé, bạn còn nhớ gì về cái vụ đó nữa không. Tại sao lại phải chọn mồi dài như vậy. Mình xin tiếp thu phê bình của voh5.
voh5
Senior Member
Mồi dài ngắn do thiết kế và cho mục đích của người làm thôi bác! Hồi em làm với mấy cái loài của em, do muốn lấy cả hệ gen (mục đích giải trình tự toàn bộ hệ gen, cùng với một vài ứng dụng cho biểu hiện) nên thiết kế thêm 2 cái điểm cắt Enzyme trước trình tự mồi bình thường! Thế nên mới có chuyện primer dài tới 45-46 nu!
@Nguyen Quang Hung: Đặt cái topic xong rồi ... đem con bỏ chợ à bạn?
Ho Huu Tho
Senior Member
voh5 nói như vậy thì mình đoán là phần bắt cặp thực sự của mồi với template thực ra ngắn hơn nhiều, có phải vậy không? Theo mình hiểu thì cứ thiết kế cái mồi ngắn, sau đó chỉ việc nối thêm cho nó một cái đuôi chứa trình tự giới hạn. Như vậy khác với cái mồi dài mình đề cập ở trên.
Ho Huu Tho
Senior Member
Vừa đọc được thông tin này đúng với trí nhớ của bạn:
To limit the chance of a PCR primer binding to a sequence of DNA that is not the intended binding site (non-specific primer hybridisation), PCR primers should be designed to be between 18 and 30 nucleotides (bp) in length
voh5
Senior Member
Uhm, bác hiểu thế nào cũng được! Nhưng hiểu như bác nghĩa là bác chỉ biết template là ADN tổng số ban đầu.
Còn vụ bắt mồi, đương nhiên theo lý thuyết thì ban đầu là thế, primer chỉ bắt cặp với template ở doạn ngắn như bác nghĩ, nhưng tính từ chu kỳ thứ 2 (theo lý thuyết cho 1 cặp primer/1 adn khuôn) thì bắt cặp sẽ là của đoạn dài, để tạo ra sản phẩm là đoạn gen có độ dài bằng độ dài bình thường + phần thêm trình tự giới hạn, và tính từ chu kỳ thứ 3 thì nó cứ thế mà nhân lên với khuôn sẽ là sản phẩm của chu kỳ hai! KHông biết em miêu tả bằng chữ như thế này bác có hình dung ra không? Còn vẽ ra cái thì đơn giản để hiểu lắm bác à.
Túm lại, các bác lai ADN/ADN dược đoạn dài dài, thì em lai ADN/primer cũng được đoạn ngắn ngắn, tầm 45-46 nu như em nói ấy!
Vụ mồi dài mồi ngắn của bác với tăng nhiệt độ bám mồi lên hay xuống thì em không quan tâm, chỉ giải thích là em đã từng làm mồi dài tới như thế thôi. Vụ này em stop tại đây, vì chẳng thấy chủ thớt bàn bạc gì về ... kinh nghiệm thiết kế primers của bác ấy cả!
Ho Huu Tho
Senior Member
Mình đã hiểu ý của voh5, cảm ơn bạn nhiều.Uhm, bác hiểu thế nào cũng được! Nhưng hiểu như bác nghĩa là bác chỉ biết template là ADN tổng số ban đầu.
Còn vụ bắt mồi, đương nhiên theo lý thuyết thì ban đầu là thế, primer chỉ bắt cặp với template ở doạn ngắn như bác nghĩ, nhưng tính từ chu kỳ thứ 2 (theo lý thuyết cho 1 cặp primer/1 adn khuôn) thì bắt cặp sẽ là của đoạn dài, để tạo ra sản phẩm là đoạn gen có độ dài bằng độ dài bình thường + phần thêm trình tự giới hạn, và tính từ chu kỳ thứ 3 thì nó cứ thế mà nhân lên với khuôn sẽ là sản phẩm của chu kỳ hai! KHông biết em miêu tả bằng chữ như thế này bác có hình dung ra không? Còn vẽ ra cái thì đơn giản để hiểu lắm bác à.
Túm lại, các bác lai ADN/ADN dược đoạn dài dài, thì em lai ADN/primer cũng được đoạn ngắn ngắn, tầm 45-46 nu như em nói ấy!
Vụ mồi dài mồi ngắn của bác với tăng nhiệt độ bám mồi lên hay xuống thì em không quan tâm, chỉ giải thích là em đã từng làm mồi dài tới như thế thôi. Vụ này em stop tại đây, vì chẳng thấy chủ thớt bàn bạc gì về ... kinh nghiệm thiết kế primers của bác ấy cả!
Primer dài nhất mà mình từng thiết kế dài 75 nucleotides, với Tm = 71 nhưng khi PCR mình dùng Ta = 55 thôi cũng ko có vấn đề gì.
Primer dài hay ngắn thì tùy thuộc vào mục đích. Trong ví dụ trên của mình là do mình muốn gắn thêm Flag tag, linker và restriction site.
Primer dài hay ngắn thì tùy thuộc vào mục đích. Trong ví dụ trên của mình là do mình muốn gắn thêm Flag tag, linker và restriction site.
Ho Huu Tho
Senior Member
Theo mình suy luận thì mồi dài, nhất là khi dài đến 50-70 nu thì sẽ làm tăng nguy tạo thành dimer do các primer tự bắt cặp nếu tiến hành PCR ở nhiệt độ thấp. Nên theo chủ quan, mình thấy khi đã thiết kế mồi dài thì nên tiến hành PCR với nhiệt độ gắn mồi cao tương ứng với Tm của nó.
Bạn Thọ hiểu nhầm rồi. Nhiệt độ gắn mồi chỉ tính cho các Nu bắt cặp với khuôn gốc thôi. Các nu thêm vào như vị trí cắt RE, tag hay linker không tính.
Một khi đã tạo thành sản phẩm đặc hiệu, các chu kỳ sau có lẽ nhiệt độ gắn mồi không còn quan trọng nữa vì sp đã được xác định bằng cặp mồi đó rồi.
Một khi đã tạo thành sản phẩm đặc hiệu, các chu kỳ sau có lẽ nhiệt độ gắn mồi không còn quan trọng nữa vì sp đã được xác định bằng cặp mồi đó rồi.
Ho Huu Tho
Senior Member
Đồng ý với bạn ý thứ nhất.
Ý thứ 2 vẫn còn hơi lăn tăn: vậy theo bạn thì các chu kỳ đầu nhiệt độ gắn mồi vẫn quan trọng và nếu thấp như vậy sẽ tạo ra các dimer phải không? Trong PCR thì các chu kỳ đầu rất quan trọng và nếu sản phẩm phụ mà được tạo ra trong chu kỳ đầu sẽ được nhân lên tiếp trong 30 chu kỳ tiếp theo.
Việc tạo thành dimer không phải do primer ngắn dài mà do đầu 3' của primer, hoặc cặp primer có bắt cặp với nhau hay không. Thật tình tôi chưa gặp trường hợp primer dimer mặc dù khi thiết kế luôn kiểm tra xem mồi có primer dimer hay không. Nhưng phần mềm tôi dùng (FastPCR) không có cách kiểm tra xem mồi xuôi và mồi ngược có dimer hay không mà chỉ kiểm tra xem mỗi mồi có tự dimer hay không. Nếu cảm thấy lo lắng về primer dimer thì có thể xê dịch 2-3 Nu sao cho phần đầu 3' nó không bổ sung nhau nữa là được.
Ho Huu Tho
Senior Member
Đồng ý với bạn là do đầu 3' của primer, nhưng bạn có nghĩ rằng khi primer dài thì xác suất để đầu 3' của primer bắt cặp với nhau hay bắt cặp với chính nó để tạo thành dimer lớn hơn không? Mình cũng gặp khó khăn khi phân tích dimer của hai mồi khác nhau nên mặc dù đã kiểm tra dimer của từng mồi rồi vẫn không thể chắc chắn là không tạo dimer được. Hơn nữa, trong một số trường hợp không có nhiều lựa chọn, chúng ta đành phải chọn cả mồi biết là nó có thể bắt cặp ở đầu 3' nhưng với mức năng lượng tự do tương đối thấp. Thế nên mình nghĩ là nên tiến hành ở nhiệt độ gắn mồi cao nếu có thể. Tuy nhiên trong thực tế, có trường hợp tiến hành ở nhiệt độ thấp mà cũng không sao như bạn thì cũng là điều bình thường của PCR.
Một số kinh nghiệm thiết kế mồi qua đọc tài liệu và kinh nghiệm bản thân của mình, Thầy giáo của em cũng chỉ dẫn cho nhiều điều.
Mồi chúng ta sử dụng thường được chia làm hai loại.
Mồi chung (universal/degenerate primers): được thiết kế trên các vùng bảo thủ cao, có khả năng phát hiện các đối tượng khác hẳn nhau.
Mồi đặc hiệu (specific primers): được thiết kế trên các vùng có thể phân biệt được loài, thậm chí dưới loài như chủng/nòi/type sinh học…
[FONT="] [/FONT]Tự thiết kế mồi
Để tự thiết kế mồi dựa trên các chuỗi gen sẵn có trên Genbank, người ta cần sử dụng một phần mềm có khả năng căn trình tự đa chuỗi (multiple sequence alignment), chẳng hạn ClustalX, Bioedit. Ngay sau khi các chuỗi DNA đã được căn trình tự, chúng ta có thể thiết kế các mồi chung hay mồi đặc hiệu tùy theo yêu cầu.
Các chú ý khi thiết kế mồi
Độ dài mồi. Nên nằm trong khoảng 18-22 nts. Độ dài này đủ dài để đảm bảo tính đặc hiệu và đủ ngắn để mồi gắn đễ dàng vào khuôn.
Nhiệt độ tách chuỗi (Tm = Melting Temperature). Tm là nhiệt độ mà tại đó 1/2 số sợi DNA kép tách thành sợi đơn. Tm của mồi nên nằm trong khoảng 52-58 oC.
Nhiệt độ gắn mồi (Ta = annealing temperature). Ta được tính dựa trên Tm. Ta quá cao làm mồi khó gắn vào khuôn dẫn tới năng xuất PCR thấp. Ta quá thấp làm mồi dễ gắn không đặc hiệu vào khuôn dẫn tới tạo các sản phẩm không đặc hiệu. Ta của 2 mồi xuôi và ngược dòng nên tương đương. Có nhiều cách tính Ta
Ta = 0.3 x Tm(mồi) + 0.7 Tm (sản phẩm) – 14.9
Hàm lượng GC. Số các gốc G và C nên nămg trong khoảng 40-60%.
Chuỗi GC đầu 3’. Đầu tận cùng 3 ‘ nên là G hoặc C hoặc GC hoặc CG. Đầu 3’ không nên có nhiều hơn 3 gốc liên tục G/C.
Cấu trúc thứ cấp. Cấu trúc thứ cấp có thể hình thành trong cùng một mồi hoặc giữa 2 mồi. Mồi chứa cấu trúc thứ cấp xấu thường dẫn tới năng suất PCR bị giảm, thậm chí không có sản phẩm. Tính ổn định của cấu trúc thứ cấp được đo bằng ΔG (là năng lượng cần để phá vỡ cấu trúc thứ cấp, được tính từ các phần mềm thiết kế mồi). Các loại cấu trúc thứ cấp là
Hairpins. Là cấu trúc thứ cấp hình thành trong nội bộ mồi. Giá trị ΔG của các hairpin đầu 3’ không nên <-2 kcal/mol và của các hairpin ở giữa không nên <-3 kcal/mol.
Tự mồi (Self Dimer). Là cấu trúc hình thành giưã các phân tử của cùng loại mồi. Giá trị ΔG của các hairpin đầu 3’ không nên <-5 kcal/mol và của các hairpin ở giữa không nên <-6 kcal/mol.
Tự mồi chéo (Cross Dimer). Là cấu trúc hình thành giữa các phân tử của 2 mồi khác nhau (cặp mồi trong phản ứng PCR). Giá trị ΔG của các hairpin đầu 3’ không nên <-5 kcal/mol và của các hairpin ở giữa không nên <-6 kcal/mol.
Các chuỗi lặp. Mồi không nên chứa nhiều chuỗi lặp kép (ví dụ TATATATA) hoặc chuỗi lặp đơn (ví dụ TTTT) vì có thể gây ra hiện tượng bắt cặp nhầm (misprime). Trong một mồi, chỉ nên có tối đa 4 chuỗi lặp. Các chuỗi lặp cũng không nên xuất hiện nhiều lần trong 1 mồi
Độ ổn định đầu 3 ‘. Tận cùng đầu 3’ (khoảng 5 nts) không nên chứa toàn gốc G hoặc C vì có giá trị ΔG cao dễ dẫn tới bắt cặp không đặc hiệu vào khuôn. Trái lại nếu đầu 3’ chứa quá nhiều gốc T hoặc A sẽ khó bắt cặp.
Vùng thiết kế mồi của khuôn. vùng thiết kế mồi của khuôn không nên chứa quá nhiều cấu trúc thứ cấp. Nếu các cấu trúc thứ cấp này ổn định ở nhiệt độ gắn mồi thì mồi sẽ không thể bắt cặp được.
[FONT="][/FONT][FONT="]Thiết kế mồi chung (degenerate primer)[/FONT][FONT="][/FONT]
Mồi chung là một mồi được thiết kế trên vùng bảo thủ. Nếu vùng bảo thủ là đồng nhất thì mồi chung sẽ chỉ là một chuỗi mồi duy nhất. Nếu vùng bảo thủ chứa các vị trí sai khác thì mồi chung thực chất là một hỗn hợp các mồi, mỗi mồi tương ứng với một sai khác nucleotide.
Trong thiết kế mồi chung, người ta sử dụng các mã suy biến tại các vị trí sai khác, ví dụ R là A hoặc G (số suy biến = 2); Y là C hoặc T (số suy biến bằng 2); N là A hoặc T hoặc G hoặc C (số suy biến bằng 4). Số sai khác nucleotide tại mỗi vị trí của mồi được gọi là các số suy biến. Tổng số mồi trong hỗn hợp sẽ bằng tích của tất cả các số suy biến tại mỗi vị trí. Để làm giảm số lượng mồi trong hỗn hợp, người ta thường sử dụng một nucleotide đặc biệt là inosine. Inosine có thể ghép cặp với bất kỳ nucleotide nào trong số 4 nucleotide A, T, G, C.
Phần mềm
[FONT="]Các phần mềm thiết kế mồi và phân tích mồi có thể tải hoặc thực hiện trực tuyến tại website sau: [/FONT][FONT="]http://primer3.sourceforge.net/webif.php[/FONT]
Có được các mồi tốt là bước quan trọng nhất trong trong các kỹ thuật khuếch đại gel. có hai cách để có được mồi tốt.
Tham khảo và lựa chọn từ các nghiên cứu đã được công bố.
Tự thiết kế mồi.
Mồi chúng ta sử dụng thường được chia làm hai loại.
Mồi chung (universal/degenerate primers): được thiết kế trên các vùng bảo thủ cao, có khả năng phát hiện các đối tượng khác hẳn nhau.
Mồi đặc hiệu (specific primers): được thiết kế trên các vùng có thể phân biệt được loài, thậm chí dưới loài như chủng/nòi/type sinh học…
[FONT="] [/FONT]Tự thiết kế mồi
Để tự thiết kế mồi dựa trên các chuỗi gen sẵn có trên Genbank, người ta cần sử dụng một phần mềm có khả năng căn trình tự đa chuỗi (multiple sequence alignment), chẳng hạn ClustalX, Bioedit. Ngay sau khi các chuỗi DNA đã được căn trình tự, chúng ta có thể thiết kế các mồi chung hay mồi đặc hiệu tùy theo yêu cầu.
Các chú ý khi thiết kế mồi
Độ dài mồi. Nên nằm trong khoảng 18-22 nts. Độ dài này đủ dài để đảm bảo tính đặc hiệu và đủ ngắn để mồi gắn đễ dàng vào khuôn.
Nhiệt độ tách chuỗi (Tm = Melting Temperature). Tm là nhiệt độ mà tại đó 1/2 số sợi DNA kép tách thành sợi đơn. Tm của mồi nên nằm trong khoảng 52-58 oC.
Nhiệt độ gắn mồi (Ta = annealing temperature). Ta được tính dựa trên Tm. Ta quá cao làm mồi khó gắn vào khuôn dẫn tới năng xuất PCR thấp. Ta quá thấp làm mồi dễ gắn không đặc hiệu vào khuôn dẫn tới tạo các sản phẩm không đặc hiệu. Ta của 2 mồi xuôi và ngược dòng nên tương đương. Có nhiều cách tính Ta
Ta = 0.3 x Tm(mồi) + 0.7 Tm (sản phẩm) – 14.9
Hàm lượng GC. Số các gốc G và C nên nămg trong khoảng 40-60%.
Chuỗi GC đầu 3’. Đầu tận cùng 3 ‘ nên là G hoặc C hoặc GC hoặc CG. Đầu 3’ không nên có nhiều hơn 3 gốc liên tục G/C.
Cấu trúc thứ cấp. Cấu trúc thứ cấp có thể hình thành trong cùng một mồi hoặc giữa 2 mồi. Mồi chứa cấu trúc thứ cấp xấu thường dẫn tới năng suất PCR bị giảm, thậm chí không có sản phẩm. Tính ổn định của cấu trúc thứ cấp được đo bằng ΔG (là năng lượng cần để phá vỡ cấu trúc thứ cấp, được tính từ các phần mềm thiết kế mồi). Các loại cấu trúc thứ cấp là
Hairpins. Là cấu trúc thứ cấp hình thành trong nội bộ mồi. Giá trị ΔG của các hairpin đầu 3’ không nên <-2 kcal/mol và của các hairpin ở giữa không nên <-3 kcal/mol.
Tự mồi (Self Dimer). Là cấu trúc hình thành giưã các phân tử của cùng loại mồi. Giá trị ΔG của các hairpin đầu 3’ không nên <-5 kcal/mol và của các hairpin ở giữa không nên <-6 kcal/mol.
Tự mồi chéo (Cross Dimer). Là cấu trúc hình thành giữa các phân tử của 2 mồi khác nhau (cặp mồi trong phản ứng PCR). Giá trị ΔG của các hairpin đầu 3’ không nên <-5 kcal/mol và của các hairpin ở giữa không nên <-6 kcal/mol.
Các chuỗi lặp. Mồi không nên chứa nhiều chuỗi lặp kép (ví dụ TATATATA) hoặc chuỗi lặp đơn (ví dụ TTTT) vì có thể gây ra hiện tượng bắt cặp nhầm (misprime). Trong một mồi, chỉ nên có tối đa 4 chuỗi lặp. Các chuỗi lặp cũng không nên xuất hiện nhiều lần trong 1 mồi
Độ ổn định đầu 3 ‘. Tận cùng đầu 3’ (khoảng 5 nts) không nên chứa toàn gốc G hoặc C vì có giá trị ΔG cao dễ dẫn tới bắt cặp không đặc hiệu vào khuôn. Trái lại nếu đầu 3’ chứa quá nhiều gốc T hoặc A sẽ khó bắt cặp.
Vùng thiết kế mồi của khuôn. vùng thiết kế mồi của khuôn không nên chứa quá nhiều cấu trúc thứ cấp. Nếu các cấu trúc thứ cấp này ổn định ở nhiệt độ gắn mồi thì mồi sẽ không thể bắt cặp được.
[FONT="][/FONT][FONT="]Thiết kế mồi chung (degenerate primer)[/FONT][FONT="][/FONT]
Mồi chung là một mồi được thiết kế trên vùng bảo thủ. Nếu vùng bảo thủ là đồng nhất thì mồi chung sẽ chỉ là một chuỗi mồi duy nhất. Nếu vùng bảo thủ chứa các vị trí sai khác thì mồi chung thực chất là một hỗn hợp các mồi, mỗi mồi tương ứng với một sai khác nucleotide.
Trong thiết kế mồi chung, người ta sử dụng các mã suy biến tại các vị trí sai khác, ví dụ R là A hoặc G (số suy biến = 2); Y là C hoặc T (số suy biến bằng 2); N là A hoặc T hoặc G hoặc C (số suy biến bằng 4). Số sai khác nucleotide tại mỗi vị trí của mồi được gọi là các số suy biến. Tổng số mồi trong hỗn hợp sẽ bằng tích của tất cả các số suy biến tại mỗi vị trí. Để làm giảm số lượng mồi trong hỗn hợp, người ta thường sử dụng một nucleotide đặc biệt là inosine. Inosine có thể ghép cặp với bất kỳ nucleotide nào trong số 4 nucleotide A, T, G, C.
Bảng Mã suy biến trong thiết kế mồi chung
Viết tắt
Nucleotide tương ứng
Số suy biến
R
A hoặc G
2
Y
C hoặc T
2
M
A hoặc C
2
K
G hoặc T
2
W
A hoặc T
2
S
C hoặc G
2
B
C hoặc G hoặc T
3
D
A hoặc G hoặc T
3
H
A hoặc C hoặc T
3
V
A hoặc C hoặc G
3
N
A hoặc C hoặc G hoặc T
4
i
Inosine
1
Phần mềm
[FONT="]Các phần mềm thiết kế mồi và phân tích mồi có thể tải hoặc thực hiện trực tuyến tại website sau: [/FONT][FONT="]http://primer3.sourceforge.net/webif.php[/FONT]
Có được các mồi tốt là bước quan trọng nhất trong trong các kỹ thuật khuếch đại gel. có hai cách để có được mồi tốt.
Tham khảo và lựa chọn từ các nghiên cứu đã được công bố.
Tự thiết kế mồi.
Ho Huu Tho
Senior Member
Cảm ơn biopass giới thiệu một bài dài về kinh nghiệm thiết kế mồi, có một số nội dung tôi thấy không chuẩn nhưng không biết nên góp ý từ đâu.Một số kinh nghiệm thiết kế mồi qua đọc tài liệu và kinh nghiệm bản thân của mình, Thầy giáo của em cũng chỉ dẫn cho nhiều điều.
