Thiết kế mồi cho phản ứng tổng hợp cDNA.

[Ho Huu Tho]

Mình có được đọc khá nhiều thông tin bổ ích trong diễn đàn về thiết kế mồi cho phản ứng PCR. Nhưng mình chưa tìm thấy thông tin liên quan đến việc thiết kế mồi cho phản ứng tổng hợp cDNA (reverse transcription) sử dụng mồi đặc hiệu cho gen quan tâm. Mình rất mong được tham khảo kinh nghiệm của các bạn.

 

[windtalker8x]

Mình cũng nghe nói có mồi đặc hiệu cho trình tự RNA sử dụng cho giai đoạn RT nhưng không biết thiết kế như thế nào. Từ trước tới giờ mình toàn tổng hợp cDNA bằng mồi ngẫu nhiên (random hexamer) hoặc mồi OligoT, sau đó mới khuếch đại đoạn gen mong muốn bằng mồi đặc hiệu. Rất mong được các bạn nào biết chỉ giáo.

 

[tran van giang]

Thiết kế mồi cho RTPCR

Chào bạn,
Khi mình tạo cDNA thì mình có thể dùng mồi ngẫu nhiên khi muốn xác định RT tổng số hoặc mồi đặc hiệu. Mồi ngẫu nhiên thì đơn giản, còn mồi đặc hiệu thì việc thiết kế mồi cũng giống như mồi cho PCR bình thường, cũng quan tâm đến nhiệt độ bắt cặp, thời gian và độ bền vững của mồi. Nhưng bạn phải chú ý là bạn nghiên cứu sợn ARN sense hay antisense thì sẽ thiết kế mồi theo chiều sense hay antisense.
Chúc bạn may mắn.

 

[nthanh]

Chào bạn, mình có 1 thắc mắc về thiết kế mồi RT-PCR khi mà mình biểu hiện gen mà mình quan tâm. Vì ở đây mình không có thư viện cDNA, nên mình phải làm trực tiếp bằng RT-PCR. Vậy mồi thiết kế cần lưu ý gì? về trình tự, vị trí so với gen (vì mình muốn biểu hiện mà), vì mình nghĩ là nó phải liên quan tới promoter.

 

[tran van giang]

Rt_pcr

Chào bạn,
Bạn biểu hiện gen bằng tế bào nào? tức là vi khuẩn hay thực vật, vì nếu biểu hiện gen trong vector thì bạn cần chú ý đến khung đọc của bạn bắt đầu từ đâu, còn thông thường thì dùng promotor mạnh của vertor trong biểu hiện nên bạn không phải lo. Bạn nói cụ thể các bước bạn cần làm gì thì mình mới nói kỷ được?
1. Bạn đã xác định được protein của bạn được tổng hợp từ ARN sense hay antisense chưa? Bạn có mồi ngẫu nhiên chưa? Random Primer? Trình tự gen mã hóa protein của bạn đã có chưa? bạn làm RT PCR theo kit nao?
2. Mồi cho PCR thông thường bạn đã thiết kế nhiều rồi chứ?
Có gì thì trao đổi tiếp nhé?

 

[nthanh]

Mình biểu hiện gen bằng tế bào động vật bạn ạ, sử dụng vector virus, đó là hướng nghiên cứu thôi, chứ bây giờ mình đang bắt đầu từ việc tạo dòng cDNA của gen đích thôi, nhưng chưa có kinh nghiệm vì tìm tài liệu họ toàn dùng thư viện cDNA. Mình cũng đã đọc sách về thiết kế mồi rồi, họ cũng nói về cá nguyên tắc cơ bản như thiết kế mồi PCR thông thường, tuy nhiên có những trình tự không được như vậy của gen mình quan tâm, vì thế mìnhn muốn tham khảo và mọi người chia sẻ về kinh nghiệm trong vấn đề này. còn mồi PCR thông thường thì thiết kế và sử dụng nhiều rồi.

 

[tran van giang]

mARN bạn nghiên cứu nó nằm trên sợi sense hay antisense? Nếu mARN sense thì bạn làm CDNA với mồi antisense, và ngược lại, việc thiết kế mồi ngược thì hơi khó chút, còn lại thì bình thường. KHi nao bạn làm thì chắc mình sẽ nói cụ thế hơn.
Vì cái này nói đây không tưởng tượng ra được, hihi. Sau khi làm cDNA, bạn PCR rồi nhanh dòng bình thường nếu RT thành công.
Không khó đâu bạn ah, mình 1 gen mình làm 1 tuần, nhưng biểu hiện thì bạn phải chú ý vùng promotor và cách cắt nối của ARN.

 

[hoang xuan hung]

Chào cả nhà!
Mình đang tìm hiểu về kỹ thuật RT-PCR trên EV71 (enterovirus gây bệnh tay chân miệng), mình dự định tự thiết kế mồi cho phản ứng RT-PCR, mình đã tìm hiểu và thấy người ta làm trên vùng gene VP1 của EV71. Khi mình lên Genebank để lấy các trình tự nucleotide thì trình tự đó hình như là trình tự C-DNA. Mình muốn khuyeesch đại cả vùng VP1, hoặc 1 gene nguyên vẹn trên vùng này thì phải làm thế nào?
Cả nhà giúp mình với nhé!
Kiến thức của mình về vấn đề này còn sơ khai lắm, có gì sai sót mong được bỏ qua!