Cho em hỏi về nhiệt độ trong chu kì PCR

[tanu191189]

Em đang thực hành phát hiện bệnh hoại tử thần kinh ở cá chẽm bằng phương pháp PCR với kit IQ2 thì làm 2 bước
Bước 1 là RT-PCR gồm:
- 1 chu kì 42 độ C trong 30s
92 độ C trong 2ph
- 25 chu kì 94 độ C trong 20s
62 độ C trong 20s
72 độ C trong 30s
- 1 chu kì 72 độ C trong 32s
20 độ C trong 30s.
Đưa về 4 độ C.
Bước 2 là Nested PCR gồm:
- 30 chu kì 92 độ C trong 20s
62 độ C trong 20s
72 độ C trong 30s
- 1 chu kì 72 độ C trong 30s
20 độ C trong 30s.
Đưa về 4 độ C.
Mấy bước nhiệt kia thì em hiểu nhưng ở chu kì cuối của mỗi bước đều có 20 độ C trong 30s có tác dụng j em không hiểu. Có ai giải thích dùm em không ạ? Em cảm ơn trước.

 

[ducthanhhus88]

Theo tớ hiểu thì 2 bước này phài làm riêng rẽ nhau, vì RT-PCR và PCR lồng đòi hỏi hỗn hợp mix khác nhau. Còn bước 20 độ C trong 30s, theo mình nghĩ đó là nhiệt độ cần thiết để ADN hồi biến hay bắt cặp lại với nhau. Máy PCR rất nhạy và khả năng về 4 độ C là rất nhanh, do vậy nên có bước này để thu ADN tốt hơn.

 

[Ho Huu Tho]

cai chu trinh nhiet nay kho hieu qua nhi, ai do biet giai thich cho moi nguoi thu xem cai. Ah, ban da doc tai lieu huong dan cua kit chua, ho co giai thich gi ve chu trinh nhiet nay khong?

 

[nehigoha]

Bước 1 là RT-PCR gồm:
- 1 chu kì 42 độ C trong 30s
nhiệt độ để reverse trancriptase hoạt động
92 độ C trong 2ph
inactivate reverse transcriptase. heat up samples
- 25 chu kì 94 độ C trong 20s
denature
62 độ C trong 20s
anneal
72 độ C trong 30s
amplify
- 1 chu kì 72 độ C trong 32s
nếu DNA polymerase chưa hoàn tất amplifying thì có cơ hội hoàn thành nhiệm vụ và rời khỏi DNA
20 độ C trong 30s.
trong hầu hết các protocol không có bước này. chắc là để làm lạnh từ từ
Đưa về 4 độ C.

 

[Ho Huu Tho]

Truoc het xin cam on ban, nhung minh co thac mac la thuong reverse transcription thi phai tien hanh trong khoang thoi gian xap xi 1 gio, tai sao o day lai chi co 30 giay. Minh cung chua bao gio thay buoc 20 do nay bao gio ca, khong biet day la phat minh cua ai, tu nuoc nao va co doc quyen sang che khong day?

 

[nehigoha]

ừm, 30s là ko hợp lý. Lúc mới đọc Nê tưởng 30min.
cái bước 20 độ C kia chắc cũng ko harm gì mấy tại vì mình sẽ heat mix tới 92 độ trước khi bắt đầu nested PCR

 

[Lê Đức Dũng]

ừm, 30s là ko hợp lý. Lúc mới đọc Nê tưởng 30min.
cái bước 20 độ C kia chắc cũng ko harm gì mấy tại vì mình sẽ heat mix tới 92 độ trước khi bắt đầu nested PCR

Mình thì chưa làm RT PCR lồng kiểu này nhưng mình lại làm từng bước rời.
cDNA thường được tổng hợp trong 1h ở 37 độ , sau đó 3 phut 96 độ. Sau đó cùng cDNA là PCR thường thôi. Nên ở đấy quả thực 30s đầu không hiểu đẻ làm gì nhỉ ?? bạn gì đấy thử đọc Kit nó bảo...mần răng.

 

[nehigoha]

tùy thuộc vào RT mà nhiệt độ của RT rxn sẽ khác nhau.
Ví dụ: AMV-RT: 42 độ, superscript III: 50 độ

 

[Ho Huu Tho]

Xin loi vi cung hoi lan man mot ti, nhung minh co thac mac la lam sao de kiem soat duoc hieu suat cua phan ung reverse transcription, vi hieu suat nay se ti le voi ket qua dinh luong PCR trong phat hien mam benh virus ARN (vi thuc te la chung ta chi dinh luong duoc cDNA chu co dinh luong RNA cua virus dau). Ah, ma thuc hien phan ung reverse transcription o cac nhiet do khac nhau nhu vay lieu hieu suat co khac nhau khong nhi, vi khi tang nhiet do thi moi se bat cap kem hon, lại con emzym khac nua chu. Voi lai su bat cap va khoi dong phan ung cua reverse transcriptase co giong voi bat cap va khoi dong cua Taq polymerase khong nhi (cai su so sanh nay hinh nhu khap khieng va roi hoi qua nhi). Hu hu, lan man wa!

 

[nehigoha]

Xin loi vi cung hoi lan man mot ti, nhung minh co thac mac la lam sao de kiem soat duoc hieu suat cua phan ung reverse transcription, vi hieu suat nay se ti le voi ket qua dinh luong PCR trong phat hien mam benh virus ARN (vi thuc te la chung ta chi dinh luong duoc cDNA chu co dinh luong RNA cua virus dau).

Nếu muốn định lượng RNA thì người ta dùng phương pháp qRT-PCR, hay còn gọi là real-time PCR. dùng phương pháp gene normalization. Chọn 1 gene nào đó được biểu hiện thường xuyên và ở mức độ không thay đổi, thường là house-keeper genes, để RT. Vì dA (1 loạt các Adenine) được thêm vào đuôi RNA để kết thúc transcription rxn nên ta sẽ dùng oligo dT để làm primer cho RT rxn. Sau đó thì dùng primer đặc hiệu cho interested genes cho real-time PCR.

Ah, ma thuc hien phan ung reverse transcription o cac nhiet do khac nhau nhu vay lieu hieu suat co khac nhau khong nhi, vi khi tang nhiet do thi moi se bat cap kem hon, lại con emzym khac nua chu. Voi lai su bat cap va khoi dong phan ung cua reverse transcriptase co giong voi bat cap va khoi dong cua Taq polymerase khong nhi (cai su so sanh nay hinh nhu khap khieng va roi hoi qua nhi). Hu hu, lan man wa!

Có 2 loại hiệu suất: hiệu suất primer anneal với RNA và hiệu suất của reverse transcriptase. Hiệu suất của reverse transcriptase thì tùy thuộc vào nhiệt độ của RT rxn. Có lẽ bạn thắc mắc về hiệu suất của annealing. Thông thường thì ta sẽ heat RT mix (chưa có enzyme) để denature RNA rồi sau đó làm lạnh mix trên ice để primer anneal với RNA. Rồi mới add enzyme vào mix cho RT rxn.

Voi lai su bat cap va khoi dong phan ung cua reverse transcriptase co giong voi bat cap va khoi dong cua Taq polymerase khong nhi (cai su so sanh nay hinh nhu khap khieng va roi hoi qua nhi). Hu hu, lan man wa!

Hầu hết các loại enzyme đều bị bất hoạt ở nhiệt độ cao, reverse transcriptase cũng vậy. Tuy nhiên, bộ máy enzyme những sinh vật sống trong miệng núi lửa có thể chịu đựng nhiệt độ rất cao. Vì vậy người ta nghiên cứu DNA polymerase của các sinh vật này rồi engineer chúng. Đó là lý do Taq, Pfu, Vent... không bị bất hoạt trong quá trình PCR. Người ta cũng engineer một số DNA polymerase để chúng chỉ có thể hoạt động sau khi activate ở nhiệt độ rất cao.

 

[Ho Huu Tho]

Nếu muốn định lượng RNA thì người ta dùng phương pháp qRT-PCR, hay còn gọi là real-time PCR. dùng phương pháp gene normalization. Chọn 1 gene nào đó được biểu hiện thường xuyên và ở mức độ không thay đổi, thường là house-keeper genes, để RT. Vì dA (1 loạt các Adenine) được thêm vào đuôi RNA để kết thúc transcription rxn nên ta sẽ dùng oligo dT để làm primer cho RT rxn. Sau đó thì dùng primer đặc hiệu cho interested genes cho real-time PCR.

Cai realtime PCR nay thuc ra la de dinh luong cDNA, nhung lieu so copy cDNA nay co bang so copy RNA ma minh quan tam khong nhi? Y minh hoi hieu suat cua phan ung reverse transcription la cho nay.

Có 2 loại hiệu suất: hiệu suất primer anneal với RNA và hiệu suất của reverse transcriptase. Hiệu suất của reverse transcriptase thì tùy thuộc vào nhiệt độ của RT rxn. Có lẽ bạn thắc mắc về hiệu suất của annealing. Thông thường thì ta sẽ heat RT mix (chưa có enzyme) để denature RNA rồi sau đó làm lạnh mix trên ice để primer anneal với RNA. Rồi mới add enzyme vào mix cho RT rxn.

The tai sao trong phan ung PCR, nguoi ta chi can ha nhiet do den khoang 54 do C la primer da co the anneal voi target DNA roi nhi. Minh se su dung primer dac hieu voi gen quan tam chu khong dung primer polydT hay hexamer. Minh thay la buoc anneal nay hinh nhu khong phu thuoc vao enzym thi phai, voi la RNA hay DNA thi deu co kha nang bat cap bo sung de tao thanh soi kep.

Hầu hết các loại enzyme đều bị bất hoạt ở nhiệt độ cao, reverse transcriptase cũng vậy. Tuy nhiên, bộ máy enzyme những sinh vật sống trong miệng núi lửa có thể chịu đựng nhiệt độ rất cao. Vì vậy người ta nghiên cứu DNA polymerase của các sinh vật này rồi engineer chúng. Đó là lý do Taq, Pfu, Vent... không bị bất hoạt trong quá trình PCR. Người ta cũng engineer một số DNA polymerase để chúng chỉ có thể hoạt động sau khi activate ở nhiệt độ rất cao.

Cam on Nê ve nhung kien thuc bo ich.

 

[Ho Huu Tho]

Mình thì chưa làm RT PCR lồng kiểu này nhưng mình lại làm từng bước rời.
cDNA thường được tổng hợp trong 1h ở 37 độ , sau đó 3 phut 96 độ. Sau đó cùng cDNA là PCR thường thôi. Nên ở đấy quả thực 30s đầu không hiểu đẻ làm gì nhỉ ?? bạn gì đấy thử đọc Kit nó bảo...mần răng.

Theo minh cai PCR long nay co muc dinh de tang do nhay va phat hien duoc so copy rat it. Nhung ma vi phai lay san pham cua phan ung PCR thu nhat dung cho phan ung PCR thu hai, nen nguy co nhiem tu mau nay sang mau khac rat cao va gay ra duong tinh gia. Khong biet bo kit co giai phap gi de khac phuc dieu nay khong?

 

[Dương Văn Cường]

The tai sao trong phan ung PCR, nguoi ta chi can ha nhiet do den khoang 54 do C la primer da co the anneal voi target DNA roi nhi. Minh se su dung primer dac hieu voi gen quan tam chu khong dung primer polydT hay hexamer. Minh thay la buoc anneal nay hinh nhu khong phu thuoc vao enzym thi phai, voi la RNA hay DNA thi deu co kha nang bat cap bo sung de tao thanh soi kep.

54 độ C hay 64 độ C hoàn toàn phụ thuộc vào trình tự của mồi. Paste cái trình tự mồi vào một phần mềm chuyên dụng nào đó (online tools cũng nhiều) và điều chỉnh vài thông số của buffer (nếu cần) là có nhiệt độ gắn mồi. Mình thường đặt annealing temp thấp hơn khoảng 3-5 độ so với nhiệt độ mà phần mềm tính ra.

Bước annealing chính xác là không có liên quan gì tới enzyme. Nó đơn thuần là quá trình chuyển động vật lý của các phân tử DNA khuôn và các phân tử oligonucleotide mồi. Một khi vô tình trên đường đời tấp nập ta gặp nhau nếu hợp khẩu vị (match) thì có thể tóm lấy nhau (liên kết hydro) và tính chuyện lâu dài.

Nhung ma vi phai lay san pham cua phan ung PCR thu nhat dung cho phan ung PCR thu hai, nen nguy co nhiem tu mau nay sang mau khac rat cao.

Bạn có thể giải thích thêm 1 chút được không? Mình không thấy có mối liên hệ gì giữa đoạn mầu xanh và đoạn mầu đỏ.

Tính đặc hiệu của nested PCR khá cao. Khi chạy vòng 1 trên genomic DNA thì cặp mồi thứ nhất tha hồ tung tăng bay nhảy để tóm cổ một vài vị trí bắt cặp trên cả mét (hay km nhỉ) DNA khuôn. Đến vòng 2 thì cặp mồi thứ 2 thường chỉ còn vài sợi khuôn mỗi sợi vài kb để bắt cặp.

 

[Pretender]

Đọc bài bạn này toét cả mắt vì không có dấu

Cai realtime PCR nay thuc ra la de dinh luong cDNA, nhung lieu so copy cDNA nay co bang so copy RNA ma minh quan tam khong nhi? Y minh hoi hieu suat cua phan ung reverse transcription la cho nay.

Cái này có lần mình hỏi nhưng mọi người bảo khó biết được lắm, mà chắc chắn là không được 100% rồi . Chỉ biết là lượng RNA dùng cho RT là giống nhau thôi, mẫu và control được processed identically. Thế nên Prof. của mình bảo tao ghét PCR lắm, nhưng thời buổi này không dùng PCR không được, cho nên muốn tao công nhận kết quả của mày thì mày phải làm ít nhất được 3 thí nghiệm giống nhau, mỗi thí nghiệm chạy 3 lần PCR, nếu tất cả kết quả đều consistent thì mới được viết vào bài

The tai sao trong phan ung PCR, nguoi ta chi can ha nhiet do den khoang 54 do C la primer da co the anneal voi target DNA roi nhi. Minh se su dung primer dac hieu voi gen quan tam chu khong dung primer polydT hay hexamer. Minh thay la buoc anneal nay hinh nhu khong phu thuoc vao enzym thi phai, voi la RNA hay DNA thi deu co kha nang bat cap bo sung de tao thanh soi kep.
.

Phụ thuộc vào primer ạ, tốt nhất là trước khi chạy mẫu chính, bạn chạy 1 cái gradient để thử xem annealing ở T nào là tốt nhất ấy cho tất cả các primer mà bạn dùng ấy. Hồi trước mình phải chạy 2 lần gradient, pipet đơ tay luôn Nhiệt độ cuối cùng mình dùng cao hơn suggested T của hãng đến 10 độ

 

[Ho Huu Tho]

54 độ C hay 64 độ C hoàn toàn phụ thuộc vào trình tự của mồi. Paste cái trình tự mồi vào một phần mềm chuyên dụng nào đó (online tools cũng nhiều) và điều chỉnh vài thông số của buffer (nếu cần) là có nhiệt độ gắn mồi. Mình thường đặt annealing temp thấp hơn khoảng 3-5 độ so với nhiệt độ mà phần mềm tính ra.

Bước annealing chính xác là không có liên quan gì tới enzyme. Nó đơn thuần là quá trình chuyển động vật lý của các phân tử DNA khuôn và các phân tử oligonucleotide mồi. Một khi vô tình trên đường đời tấp nập ta gặp nhau nếu hợp khẩu vị (match) thì có thể tóm lấy nhau (liên kết hydro) và tính chuyện lâu dài.

Trong phản ứng reverse transcription, bước annealing là sự bắt cặp giữa mồi với phân tử RNA (chứ không phải DNA). Nhiệt độ phản ứng của phản ứng này khoảng 37 – 42 độ C, vậy sự bắt cặp xảy ra vào lúc nào nhỉ? Nhân tiện xin được hỏi các bạn sự bắt cặp giữa DNA-RNA và DNA-DNA giống khác nhau thế nào, rất mong được các bạn chia sẻ.

Bạn có thể giải thích thêm 1 chút được không? Mình không thấy có mối liên hệ gì giữa đoạn mầu xanh và đoạn mầu đỏ.

Ý của mình là sau khi tiến hành phản ứng PCR thứ nhất của PCR lồng thì đã có rất nhiều sản phẩm PCR được nhân lên trong đó. Muốn tiến hành phản ứng PCR thứ hai của PCR lồng thì phải mở tube PCR thứ nhất và pipet sản phẩm của phản ứng PCR này sang tube PCR thứ hai. Những thao tác này có nguy cơ rất cao làm nhiễm sản phẩm PCR của phản ứng PCR thứ nhất ra môi trường xung quanh và nhiễm sang mẫu khác, từ đó gây ra dương tính giả của phản ứng PCR thứ hai. Việc mở tube PCR sau khi tiến hành phản ứng luôn tạo ra nguy cơ nhiễm chéo này, nhưng với PCR đơn chúng ta có thể kiểm soát việc này bằng cách tiến hành kiểm tra sản ở một không gian tách biệt với chỗ mix PCR, hoặc sử dụng realtime PCR kiểm tra sản phẩm mà không cần mở tube. Với PCR lồng, chúng ta không thể thực hiện được triệt để những biện pháp này.

 

[Ho Huu Tho]

Đọc bài bạn này toét cả mắt vì không có dấu

Thành thật cảm ơn bạn đã góp ý. Chẳng hiểu sao cái máy tính của mình đánh được tiếng Việt trong word, nhưng lại không đánh được tiếng việt trong các trang web. Hễ đánh dấu là nó tự delete luôn mới đau chứ. Cái máy tính này đúng là phản chủ mà!?

Cái này có lần mình hỏi nhưng mọi người bảo khó biết được lắm, mà chắc chắn là không được 100% rồi . Chỉ biết là lượng RNA dùng cho RT là giống nhau thôi, mẫu và control được processed identically. Thế nên Prof. của mình bảo tao ghét PCR lắm, nhưng thời buổi này không dùng PCR không được, cho nên muốn tao công nhận kết quả của mày thì mày phải làm ít nhất được 3 thí nghiệm giống nhau, mỗi thí nghiệm chạy 3 lần PCR, nếu tất cả kết quả đều consistent thì mới được viết vào bài

Những bàn luận mà bạn chia sẽ đưa ra những gợi ý thật bổ ích. Thanks.

Phụ thuộc vào primer ạ, tốt nhất là trước khi chạy mẫu chính, bạn chạy 1 cái gradient để thử xem annealing ở T nào là tốt nhất ấy cho tất cả các primer mà bạn dùng ấy. Hồi trước mình phải chạy 2 lần gradient, pipet đơ tay luôn Nhiệt độ cuối cùng mình dùng cao hơn suggested T của hãng đến 10 độ

Mình đoán là trường hợp đó bạn dùng nhiệt độ gắn mồi là xấp xỉ 65 độ, như vậy thì hơi cao. Nếu đúng như vậy bạn có thể cho mình biết là tại sao không dùng được nhiệt độ thấp hơn không?