Sds-page

[Nguyễn Duy Hưng]

Sáng nay em đã vật lộn với silver staining và kết quả vẫn là trắng bóc, trừ 2 cái land của marker. Ông thầy ko có ý kiến gì luôn. Báo cáo của nhóm em sẽ có tựa là "What the hell was going on with our gel"
Bác Lương load BSA chuẩn thì thấy rõ band là đúng rồi, chỉ có 1 loại protein thôi mà.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Silver staining bạn cần fix overnight (9-12 tiếng), tín hiệu mới rõ (nhất là tín hiệu yếu).
Nhưng trường hợp của bạn thì chắc là protein vẫn nằm ở stacking gel rồi.

 

[Nguyễn Duy Hưng]

Em đã làm lại silver staining với thời gian fixing lâu hơn và đc cái gel thế này. Nhìn hơi tởm vì nhuộm đi nhuộm lại cái gel.

 

[Phạm Văn Hậu 2]

Bạn Hưng có thể tham khảo thêm tài liệu này để defense với thầy! Tuy nhiên, bạn cũng nên chú ý về cách thức chuẩn bị mẫu cũng như nồng độ gel acrylamide như phần anh Lương trình bày.

"Typically, the separating gel used by most workers is a 15% polyacrylamide gel. This give
a gel of a certain pore size in which proteins of relative molecular mass (Mr) 10,000 move
through the gel relatively unhindered, whereas proteins of 100,000 can only just enter
the pores of this gel. Gels of 15% polyacrylamide are therefore useful for separating
proteins in the range of 100,000–10,000. However, a protein of 150,000 for example,
would be unable to enter a 15% gel. In this case, a larger-pored gel (e.g., a 10% or even
7.5% gel) would be used so that the protein could now enter the gel, and be stained and
identified. It is obvious, therefore, that the choice of gel to be used depends on the size of
the protein being studied. If proteins covering a wide range of mol-wt values need to be
separated, then the use of a gradient gel is more appropriate (see Chapter 12)".
(Source: Protein protocole Handbook, page 67)

@ anh Lương:
Cảm ơn anh chia sẽ kinh nghiệm về lượng BSA protein cho giếng khi chạy điện di. Protein vẫn có thể thấy khi anh chạy 0.1-1ug. Tuy nhiên, mình thì thường dùng 10-15ug cho mỗi giếng (cho mẫu protein trích từ thịt, cá).

"It is generally accepted that a very faint protein band detected by Coomassie brilliant blue,
is equivalent to about 0.1 μg (100 ng) of protein. Such sensitivity is suitable for many
people’s work. However if no protein bands are observed or greater staining is required,
then silver staining (Chapter 33) can be further carried out on the gel."

(Source: Protein protocole Handbook, page 67)

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Mình thích ông thầy của bạn Duy Hưng. Sinh học là khoa học thực nghiệm mà. Cứ phải "làm đi" đã. Nhiều khi kết quả không đúng như trong sách, trong papers đâu. Tất nhiên cơ sở lý thuyết tốt là điều rất cần thiết, tuy nhiên nhiều khi cũng cần kiểm chứng lại những cái mà mình cho là đúng.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Quên mất, ladder của mình 170 kDal vẫn chạy tốt vào gel 15%. Lý thuyết nhiều khi chả đúng lắm.
Trừ một số protein thật lớn (trên 300 kDa), còn lại phần lớn protein đều đi vào được gel 10% cả. Chả thế mà gel 10% thường dùng để chạy protein tổng số.
Thường với total protein, load khoảng 5 ug là đủ nhuộm SDS, load 10-15 ug băng có thể hơi phình ra.