Xin giúp protocol để xác định N-terminal sequence

[anyong]

there is nothing

there is nothing

 

[Cao Xuân Hiếu]

Trong Current Protocol in Protein Science có phần chuyển màng cho nguyên tấm 2D gel. Bước tiếp theo phụ thuộc điều kiện PTN của bạn có những máy gì?

 

[anyong]

there is nothing

 

[Cao Xuân Hiếu]

Các bước chuyển màng giống hệt như chuyển màng để làm Western. Với điều kiện là 400mA trong 2,5h là hầu hết các spot (kể các những protein MW cao, và spot to) được chuyển. Sau đấy nhuộm kiểm tra bằng Commasive 1% trong 5min. Rửa màng là biết kết quả.

 

[anyong]

there is nothing

 

[Cao Xuân Hiếu]

Phần Protocols chi tiết có trong cuốn Current Protocols in Protein Science mục 10.19: "Isolation of Proteins for Microsequence Analysis". Trong đó có thêm phần chuẩn bị hóa chất, comment và trouble shooting. Tôi ko thể chép hết ra đựoc. Anyong tìm cuốn đấy về sài cho tiện nhất là đang làm về protein. Cuốn này update định kỳ nên chọn bản càng mới càng tốt.

chuyển protein qua màng thì đơn giản, nhưng cái phưc tạp ở đây là nếu chuyển toàn bộ các spots từ 2DE sang màng PVDF thì làm sao mà xác đình N-terminal sequence của từng spot được, tôi có đọc một số bài báo nói về xác định N-terminal sequence của 2 DE, họ có nói đến chuyện cắt các spots rồi mới chuyển nhưng cô đọng quá không thể follow được.

có lẽ bạn hơi nhầm. Thực ra chiều hướng là

điện di SDS PAGE - chuyển màng - cắt spot quan tâm - sequencer từ đầu N

như vậy, điện di dùng để phân tách protein quan tâm ra khỏi hỗn hợp. 2D chỉ hơn minigel ở khả năng phân tách thôi nếu xét về mục đích này.
chuyển màng để các spot có giá thể bám thích hợp cho phản ứng cylce microsequencing.
spot quan tâm có thể nhận diện bằng MS/MS hoặc antibody.Vì chắc là bạn chỉ đọc 1 vài protein thôi chứ giá của sequencer protein cũng khá mắc.