contrairong7
Junior Member
Chào các anh chị và các bạn! Mình đang làm luận văn SHPT trên đối tượng Xoài và mình đang gặp khó khăn trong công đoạn ly trích DNA lá xoài.
* Đây là quy trình mình đang sử dụng để trích DNA lá xoài:
-Lá xoài được hái gồm 3 loại: lá non, lá trưởng thành, lá già; lá sau khi hái được ủ trong tủ lạnh 40C, dùng trong nhiều ngày sau
-Mẫu lá xoài được lau sơ bằng ethanol 700
-Cắt nhỏ lá (khoảng 1mm) cho vào tuýp (2.2), làm lạnh trong ni-tơ lỏng trong 10 phút.
-Nghiền mẫu bằng máy nghiền 3 lần, mỗi lần 1 phút 30 giây, với tần số 27 lần/s.
-Cho vào mỗi tuýp 1ml Extraction Buffer (EB) + 50 µl SDS 10%
-Ủ mẫu 650C trong 30 phút (5 phút đảo nhẹ 1 lần).
-Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút.
-Lấy phần nước trong (khoảng 800 µl) cho sang tuýp khác (bỏ cặn).
-Cho vào một lượng isopropanol tương đương (800 µl), đảo nhẹ.
-Trữ mẫu ở -200C trong 2 giờ.(có thể hơn)
-Ly tâm 12.000 rpm trong 10 phút, bỏ phần nước, giữ lại phần kết tủa.
-Cho vào 400 µl TE 0.1X để hòa tan DNA.
-Cho vào 400 µl CTAB, ủ ở 650C trong 15 phút (5 phút đảo nhẹ 1 lần).
-Cho 800 µl chloroform/isoamylacohol (24:1), đảo nhẹ.
-Ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút.
-Lấy khoảng 700 µl phần lỏng ở trên sang tuýp mới, tránh hút chạm vào màng ngăn giữa 2 lớp.
-Cho 1.4 µl ethanol 960 vào, đảo nhẹ, để ở nhiệt độ phòng(phòng máy lạnh) trong 15 phút.
-Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút, lấy phần cặn.
-Rửa phần cặn bằng ethanol 700 2 lần, mỗi lần dùng 700 µl.
-Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút, lấy phần cặn, bỏ phần lỏng.
-Sấy khô bằng máy sấy chân không ở 450C trong 10 phút.
-Hòa tan mẫu với 200 µl TE 0.1X, trữ lạnh -200C.
Phụ lục:
EB (0.1M Tris.Cl(pH8), 0.5M NaCl, 0.05 EDTA, 0.01 beta-mercapthoethanol, 1-2% PVP40)
TE 0.1X (10mM Tris pH8, 0.1mM EDTA (pH8))
CTAB (0.2M Tris.Cl (pH7.5), 2M NaCl, 0.05M EDTA, 2% CTAB)
* Vấn đề của mình là:
- DNA thu đuợc không có hoặc rất ít (không có band hoặc rất mờ khi điện di)
- Xuất hiện nhiều band lạ có KLPT nhỏ hơn DNA lá xoài trên gel điện di. Những band lạ này đồng dạng với nhau ở các mẫu thí nghiệm, và chúng rất đậm.
* Rất mong các anh chị và các bạn giải đáp dùm mình những nguyên nhân gây ra kết quả xấu trên và hướng dẫn mình cách giải quyết...T.T
* Đây là quy trình mình đang sử dụng để trích DNA lá xoài:
-Lá xoài được hái gồm 3 loại: lá non, lá trưởng thành, lá già; lá sau khi hái được ủ trong tủ lạnh 40C, dùng trong nhiều ngày sau
-Mẫu lá xoài được lau sơ bằng ethanol 700
-Cắt nhỏ lá (khoảng 1mm) cho vào tuýp (2.2), làm lạnh trong ni-tơ lỏng trong 10 phút.
-Nghiền mẫu bằng máy nghiền 3 lần, mỗi lần 1 phút 30 giây, với tần số 27 lần/s.
-Cho vào mỗi tuýp 1ml Extraction Buffer (EB) + 50 µl SDS 10%
-Ủ mẫu 650C trong 30 phút (5 phút đảo nhẹ 1 lần).
-Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút.
-Lấy phần nước trong (khoảng 800 µl) cho sang tuýp khác (bỏ cặn).
-Cho vào một lượng isopropanol tương đương (800 µl), đảo nhẹ.
-Trữ mẫu ở -200C trong 2 giờ.(có thể hơn)
-Ly tâm 12.000 rpm trong 10 phút, bỏ phần nước, giữ lại phần kết tủa.
-Cho vào 400 µl TE 0.1X để hòa tan DNA.
-Cho vào 400 µl CTAB, ủ ở 650C trong 15 phút (5 phút đảo nhẹ 1 lần).
-Cho 800 µl chloroform/isoamylacohol (24:1), đảo nhẹ.
-Ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút.
-Lấy khoảng 700 µl phần lỏng ở trên sang tuýp mới, tránh hút chạm vào màng ngăn giữa 2 lớp.
-Cho 1.4 µl ethanol 960 vào, đảo nhẹ, để ở nhiệt độ phòng(phòng máy lạnh) trong 15 phút.
-Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút, lấy phần cặn.
-Rửa phần cặn bằng ethanol 700 2 lần, mỗi lần dùng 700 µl.
-Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút, lấy phần cặn, bỏ phần lỏng.
-Sấy khô bằng máy sấy chân không ở 450C trong 10 phút.
-Hòa tan mẫu với 200 µl TE 0.1X, trữ lạnh -200C.
Phụ lục:
EB (0.1M Tris.Cl(pH8), 0.5M NaCl, 0.05 EDTA, 0.01 beta-mercapthoethanol, 1-2% PVP40)
TE 0.1X (10mM Tris pH8, 0.1mM EDTA (pH8))
CTAB (0.2M Tris.Cl (pH7.5), 2M NaCl, 0.05M EDTA, 2% CTAB)
* Vấn đề của mình là:
- DNA thu đuợc không có hoặc rất ít (không có band hoặc rất mờ khi điện di)
- Xuất hiện nhiều band lạ có KLPT nhỏ hơn DNA lá xoài trên gel điện di. Những band lạ này đồng dạng với nhau ở các mẫu thí nghiệm, và chúng rất đậm.
* Rất mong các anh chị và các bạn giải đáp dùm mình những nguyên nhân gây ra kết quả xấu trên và hướng dẫn mình cách giải quyết...T.T
