Tách chiết và tinh sạch protein

[ptg.bio]

Các phương pháp chiết rút tinh sạch và xác định protein​

I. Khái niệm
Trong các tổ chức của cơ thể sống, protein có thể ở dưới dạng tự do trong các dịch sinh vật hoặc dưới dạng kết hợp, hoặc bị cầm trong các tế bào. Hơn nữa, trong tế bào có chứa hàng nghìn loại protein khác nhau, nếu ta cần nghiên cứu từng loại protein, trước hết phải chiết rút và tinh sạch chúng. Chính vì vậy, các kỹ thuật chiết rút, tinh sạch và nghiên cứu protein luôn ở vị trí trung tâm của các nghiên cứu hóa sinh và luôn được cập nhật và hiện đại hóa.
II. Các biện pháp cần thiết để nhận protein nguyên thể
Các phương pháp chiết rút và tinh sạch protein đều dựa trên những tính chất hóa lý của protein như độ tích điện, kích thước phân tử, độ hòa tan... của protein cần chiết rút. Nhiều protein còn liên kết với các phân tử sinh học khác nên việc chiết rút các protein này còn phụ thuộc vào bản chất của các liên kết.
Muốn thu nhận được các protein nguyên thể tức là protein có tất cả tính chất tự nhiên đặc trưng của nó, cần sử dụng các biện pháp khác nhau.
2.1. Nhiệt độ
Để tách các protein khác nhau dựa trên kết tủa của chúng, người ta có thể sử dụng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt. Một điều cần lưu ý là chỉ nên dùng đối với trường hợp các protein enzyme bền với nhiệt. Dịch protein enzyme được giữ ở 50 - 70<SUP>0</SUP>C trong thời gian xác định, sau đó protein tạp đã bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm. Như vậy, dịch chiết protein thô bền với nhiệt có thể được thu nhận bằng cách cho kết tủa không thuận nghịch phần lớn các protein tạp.
Để thu nhận chế phẩm protein theo phương pháp kết tủa thuận nghịch bằng các muối trung tính, cần tiến hành ở nhiệt độ thấp, đối với dung môi hữu cơ cần tiến hành ở nhiệt độ dưới 0<SUP>0</SUP>C tránh biến tính đặc biệt là protein enzyme.
2.2. Nồng độ proton (pH)
Protein là các chất lưỡng tính, vì vậy, trong các dung dịch acid và kiềm chúng sẽ bị phân ly như sau:

<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-comfficeffice" /><o></o>​

<?xml:namespace prefix = v ns = "urn:schemas-microsoft-com:vml" /><v:shapetype id=_x0000_t75 stroked="f" filled="f" path="m@4@5l@4@11@9@11@9@5xe" oreferrelative="t" o:spt="75" coordsize="21600,21600"><v:stroke joinstyle="miter"></v:stroke><v:formulas><v:f eqn="if lineDrawn pixelLineWidth 0"></v:f><v:f eqn="sum @0 1 0"></v:f><v:f eqn="sum 0 0 @1"></v:f><v:f eqn="prod @2 1 2"></v:f><v:f eqn="prod @3 21600 pixelWidth"></v:f><v:f eqn="prod @3 21600 pixelHeight"></v:f><v:f eqn="sum @0 0 1"></v:f><v:f eqn="prod @6 1 2"></v:f><v:f eqn="prod @7 21600 pixelWidth"></v:f><v:f eqn="sum @8 21600 0"></v:f><v:f eqn="prod @7 21600 pixelHeight"></v:f><v:f eqn="sum @10 21600 0"></v:f></v:formulas><vath o:connecttype="rect" gradientshapeok="t" o:extrusionok="f"></vath><o:lock aspectratio="t" v:ext="edit"></o:lock></v:shapetype><v:shape id=_x0000_i1025 style="WIDTH: 240pt; HEIGHT: 96pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=fc223c3299645a16.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image001.jpg"></v:imagedata></v:shape><o></o>​

Do các acid amin trong chuỗi polypeptide còn tồn tại nhiều nhóm chức tự do dưới dạng các ion hóa là nguyên nhân tạo ra tính đa điện của protein. Phân tử protein rất dài nên nhóm ion tự do tận cùng của chuỗi polypeptide không đáng kể, chủ yếu các nhóm chức tự do khác của chuỗi bên (R) quyết định tính chất tích điện của phân tử protein (nhóm cacboxyl của amino acid, OH của Tyrosine, e - NH<SUB>2</SUB> của lysine, guamidin của Arginine, inidazol của histidine)
Mức độ ion hóa của các nhóm này phụ thuộc vào giá trị pH. Các nhóm acid ở dạng anion trong môi trường kiềm, các nhóm kiềm tồn tại ở dạng cation trong môi trường acid.
Như vậy, ở một giá trị pH xác định, mỗi phân tử protein có một điện tích tổng số nào đấy mà độ lớn của nó phụ thuộc vào số lượng các nhóm tích điện dương và tích điện âm. Kết quả là ở giá trị nồng độ ion hydro cố định, các protein khác nhau trong hỗn hợp sẽ có tổng điện tích khác nhau. Nhiều phương pháp dùng để tách các hỗn hợp protein đều dựa vào đặc tính này. Các phân tử protein mang điện tích tổng số (dương hoặc âm) cùng dấu đẩy nhau ra xa nên dễ tan vào dung dịch. Mỗi một protein có một giá trị pH nhất định mà ở đó tổng số điện tích âm và điện tích dương trong phân tử bằng không. Giá trị đó gọi là điểm đẳng điện của protein. Điểm đẳng điện của các acid amin trung tính có giá trị pH từ 5,6 - 7,0; đối với các acid amin có tính acid (dicarboxylic) là từ 3,0 - 3,2; đối với các acid amin có tính kiềm (diamino) là từ 9,7 - 10,8. Ở điểm đẳng điện, độ hòa tan của protein là thấp nhất, protein dễ bị kết tủa. Dựa vào tính chất này, người ta có thể tách từng phần các protein enzyme trong hỗn hợp.
Cũng giống như trường hợp tác dụng của nhiệt độ trong việc tách chiết protein, có thể dùng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của pH của môi trường. Dịch protein enzyme được giữ ở pH £ 5 trong thời gian xác định. Protein tạp bị biến tính cũng được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm. Ví dụ citochrom C cũng tan trong acid trichloracetic trong khi đó acid này làm kết tủa phần lớn protein. Như vậy các protein bền với acid có thể được tách chiết bằng cách này.
2.3. Tác nhân hóa học
Có thể dùng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ để tách chiết các protein enzyme. Phương pháp này được tiến hành dựa trện cơ sở: độ hòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với các phân tử nước. Sự tương tác đó (còn gọi là sự hydrate hóa) sẽ bị giảm xuống khi thêm vào dung dịch protein enzyme các dung môi hữu cơ hoặc các muối trung tính. Dung môi hữu cơ thường dùng là etanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu.
Khi sử dụng các dung môi hữu cơ, cần chú ý tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 5<SUP>0</SUP>C trở xuống). Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn dưới 0<SUP>0</SUP>C và có thể đến -20<SUP>0</SUP>C, như vậy có tác dụng tốt đến độ ổn định của protein enzyme.
Khi đã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng cách dùng máy ly tâm lạnh.
Các muối trung tính có thể dùng là (NH<SUB>4</SUB>)<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB>, Na<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB>, MgSO<SUB>4</SUB>... Tuy nhiên, người ta đã nhận thấy muối (NH<SUB>4</SUB>)<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB> là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại protein enzyme. Loại muối này lại rẽ tiền và phổ biến. Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bảo hòa 767g/l ở 25<SUP>0</SUP>C)
Ngoài ra nồng độ (NH<SUB>4</SUB>)<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB> cần thiết để kết tủa protein enzyme khác nhau thì khác nhau nhiều.
Ví dụ: Protease của nấm mốc dễ bị kết tủa ở 70% của (NH<SUB>4</SUB>)<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB> bảo hòa hoàn toàn, còn amilase của mầm lúa bị kết tủa ở 50% độ bảo hòa của dung dịch muối này. Điều đó nói lên tính kết tủa lựa chọn của (NH<SUB>4</SUB>)<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB> cao hơn các muối khác.
Có thể dùng (NH<SUB>4</SUB>)<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB> ở cả 2 dạng: dạng bột và dạng dung dịch bảo hòa. Khi dùng bột, người ta cho từng ít một vào dịch chiết protein enzyme. Cách cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của protein enzyme. Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có máy khuấy từ để đảm bảo sự hòa tan của muối. Khi dùng dung dịch bảo hòa, trong nhiều sách về phương pháp nghiên cứu, người ta đưa ra bảng tính số lượng muối cần thiết để pha các dung dịch có độ bão hòa khác nhau ở những nhiệt độ nhất định.
Khái niệm về số phần trăm của độ bảo hòa hoàn toàn đã được đề cập đến. Như ví dụ trên thì protein enzyme có thể bị kết tủa ở 50% (0,5) hoặc 70% (0,7) của độ bão hòa hoàn toàn của (NH<SUB>4</SUB>)<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB>. Khi cho dung dịch (NH<SUB>4</SUB>)<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB> bão hòa vào dịch chiết protein enzyme thì nồng độ (NH<SUB>4</SUB>)<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB> không tăng đột ngột. Sau khi kết tủa xong người ta thường để lắng khoảng 2 giờ hoặc qua đêm, mục đích là tạo kết tủa hoàn toàn (ở phương pháp dùng dung môi hữu cơ thì không cần để lâu). Kết tủa được lấy ra bằng cách ly tâm hoặc lọc qua phễu Buchner. Khi hòa tan kết tủa lại người ta thường thêm ion Ca<SUP>++</SUP> để làm bền protein enzyme (dùng CaCl<SUB>2</SUB> hoặc Ca(CH<SUB>3</SUB> COO)<SUB>2</SUB>
Để tiện lợi, người ta đưa ra công thức cách tính lượng (NH<SUB>4</SUB>)<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB> cho vào dịch có độ bão hòa cho trước (S<SUB>1</SUB>) để đạt đến một độ bão hòa cần thiết (S<SUB>2</SUB>)
Tùy theo trạng thái (NH<SUB>4</SUB>)<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB> cho thêm vào dịch chiết protein enzyme mà có công thức tính toán khác nhau.
- Đối với (NH<SUB>4</SUB>)<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB> ở dạng bột
x(g) = <v:shape id=_x0000_i1026 style="WIDTH: 85.5pt; HEIGHT: 34.5pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=36b7ef67846baabd.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image002.jpg"></v:imagedata></v:shape>
Trong đó V là thể tích dung dịch, S<SUB>1</SUB>, S<SUB>2</SUB> là độ bão hòa cho trước và độ bão hòa cần đạt (ví dụ: S<SUB>1</SUB> = 0,5; S<SUB>2</SUB> = 0,7 chẳng hạn).
Người ta cũng có thể dùng bản đồ toán (nomogram) để chiếu và xác định được lượng (NH<SUB>4</SUB>)<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB> thêm vào để dịch chiết protein enzyme đạt được một độ bão hòa nhất định. Hoặc có thể đối chiếu ở bảng có sẵn. Lượng (NH<SUB>4</SUB>)<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB> đưa vào để dung dịch có độ bão hòa nhất định có khác nhau tùy theo nhiệt độ thí nghiệm.
- Đối với (NH<SUB>4</SUB>)<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB> ở dạng dung dịch bão hòa.
Thể tích (tính theo ml) của dung dịch bão hòa cần cho vào 100ml dung dịch có độ bão hòa ban đầu S<SUB>1</SUB> để đạt đến một độ bão hòa S<SUB>2</SUB> cần thiết được tính theo công thức sau:
V(ml) = <v:shape id=_x0000_i1027 style="WIDTH: 68.25pt; HEIGHT: 35.25pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=898de29ec029ef18.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image003.jpg"></v:imagedata></v:shape>
Như vậy, nếu thêm từng phần các dung môi hữu cơ hoặc từng phần muối (NH<SUB>4</SUB>)<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB> (có nồng độ bão hòa khác nhau) thì ta có thể tách từng phần hỗn hợp protein enzyme. Tuy nhiên, để phân chia hoàn toàn những hỗn hợp phức tạp, phương pháp này không cho kết quả tốt vì độ hòa tan của một số protein bị tăng lên. Mặc dầu vậy, cách kết tủa từng phần này cũng rất có lợi, đặc biệt là đối với giai đoạn đầu của việc tách chiết và làm sạch protein emzyme, vì phương pháp khá đơn giản.
Ngoài ra, các tác động khác như cơ học, sóng siêu âm... có ảnh hưởng đến quá trình tách chiết protein emzyme.
III. Phá vỡ tế bào và chiết rút protein
3.1. Phá vỡ tế bào
Protein enzyme có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật. Sau khi được tổng hợp nó có thể được tiết ra ngoài tế bào tồn tại trong các dịch cơ thể, dịch môi trường (gọi là protein enzyme ngoại bào) hoặc được giữ lại bên trong tế bào (protein enzyme nội bào). Các protein enzyme nội bào có thể tồn tại ở dạng hòa tan trong tế bào chất và các bào quan (nhân, microsome, mitochondria v.v...) của tế bào. Tế bào được bao bọc bằng một lớp màng.Lớp màng này ở vi khuẩn đôi khi rất bền và dày. Người ta còn thấy nhiều protein enzyme liên kết rất chặt chẽ với các bào quan của tế bào. Các phân tử protein enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các bào quan của tế bào. Do đó để có thể chiết rút các protein enzyme nội bào, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa protein enzyme và chuyển chúng vào dung dịch.
Có thể phá vỡ cấu trúc của tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị nghiên đồng thể (homogenizator). Thiết bị này có chày thủy tinh gắn với một môtơ quay và có thể điều chỉnh được tốc độ quay theo yêu cầu. Các tế bào giữa chày thùy tinh và thành cối sẽ bị phá hủy.
Để việc phá vỡ có hiệu quả, ở mô thực vật, trước khi nghiền, người ta thường thái nhỏ mẫu để vào ngăn đá hoặc cho trương nước. (ví dụ như đối với mẫu hạt khô). Còn ở các mô của động vật như gan hoặc thận, khi chiết protein enzyme người ta cần cắt bỏ các mô liên kết.
Muốn tách được các protein trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác như sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol, acetone, glycerin, ethylacetat... và chất tẩy (detergent). Các hóa chất tốt cho việc phá vỡ các bào quan của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ.
3.2. Chiết rút protein
Sau khi đã phá vỡ cấu trúc của các tế bào tiến hành chiết xuất các protein enzyme bằng các dụng dịch đệm thích hợp, dung dịch muối trung tính hoặc bằng nước đối với protein enzyme nội bào hoặc bằng ly tâm tách tế bào đối với các protein enzyme ngoại bào: việc chọn phương pháp tách chiết protein enzyme tùy thuộc vào tính chất của protein enzyme cần nghiên cứu.
IV. Tinh sạch protein
4.1. Loại các tạp chất
Trong dịch chiết thô thu được ngoài protein enzyme còn có các protein tạp, các chất cao phân tử khác như polysaccharid, acid nucleic và các chất phân tử nhỏ như đường monose, các chất lipid, muối khoáng v.v... Để loại bỏ chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau.
Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường... là các tạp chất có phân tử lượng thấp người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex.
Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, người ta hay dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ (xem 5.2.1; 5.2.2. và 5.2.3), các phương pháp sắc ký trao đổi ion, điện di, phương pháp lọc gel.
4.2. Các kỹ thuật thông thường trong tinh sạch protein
Như trên đã trình bày, sau khi nhận được dịch chiết protein thô, người ta thường sử dụng các phương pháp khác nhau để tách chiết và đồng thời làm tinh sạch protein. Ngoài các kỹ thuật đã được giới thiệu cụ thể ở các phần trên, có thể sử dụng các phương pháp dưới đây phục vụ cho việc tinh sạch các protein.
4.2.1. Ly tâm
Một trong những kỹ thuật không thể thiếu được trong việc tách chiết và tinh chế protein là ly tâm.
Máy ly tâm được sử dụng để tách các phần khác nhau khỏi dung dịch. Người ta gọi pha lỏng là chất lỏng bên trên kết tủa, pha rắn mà thường lắng kết xuống đáy ống ly tâm được gọi là kết tủa. Thực chất, sự ly tâm tăng tốc độ kết tủa của những tiểu phần rắn nhờ lực ly tâm. Sự sai khác về tỷ trọng của nguyên liệu lơ lững so với chất lỏng càng lớn thì tốc độ kết tủa sẽ càng cao. Mặc dầu người ta coi số vòng quay trong một phút là đơn vị thông thường của lực ly tâm, nhưng quy ước ấy không thỏa mãn. Chính vì vậy, mức độ tăng lực ly tâm được đo một cách chính xác hơn bằng những bội số của trị số gia tốc của lực hút ở mặt biển, có nghĩa là được đo một lực ly tâm tương đối (relative centrifugal force, RCF) hoặc là được đo bằng các giá trị là bội số của lực hút trọng trường (xg). Công thức để tính lực ly tâm tương đối là:

<o></o>​

<v:shape id=_x0000_i1028 style="WIDTH: 48pt; HEIGHT: 39pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=6d96dbebd71e236a.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image004.jpg"></v:imagedata></v:shape><o></o>​

Trong đó r là bán kính đến đáy của ống ly tâm tính ra "phút" (foot, 1foot = 30,48cm), n là số vòng quay trong 1 giây. Có thể tính giá trị của lực ly tâm tương đối một cách trực tiếp theo công thức:
Lực ly tâm tương đối (g) = 1,1118 x 10<SUP>-5</SUP> x R x N<SUP>2</SUP>.
Trong đó R là bán kính (cm) nắp ly tâm tính từ tâm của trục đến đáy ống ly tâm, N là số vòng quay trong một phút. Cũng có thể dùng bản đồ toán (nomogram) để tính lực ly tâm tương đối
Thông thường có thể làm kết tủa những tiểu phần lớn với lực ly tâm tương đối bé bằng các máy ly tâm để bàn. Để làm kết tủa những tiểu phần bé hơn kể cả những thành phần của tế bào cần có những máy ly tâm đặc hiệu bảo đảm được các giá trị lực ly tâm tương đối cao hơn 15000 x g đối với bất kỳ định lượng nào. Có những nguyên tắc để làm việc an toàn hơn với máy ly tâm đối với người thao tác cũng như đối với nguyên liệu được xử lý mà lúc thí nghiệm cần chú ý tuân thủ. Đó là nguyên tắc cân bằng đối xứng khi ly tâm và thăng bằng máy ly tâm khi đặt máy làm việc.
Do tính chất không bền với nhiệt của phần lớn các protein enzyme, khi tách chiết tinh chế chúng, cần sử dụng máy ly tâm lạnh. Trong trường hợp điều kiện thí nghiệm có hạn chế, có thể sử dụng một số phương cách nhằm đảm bảo duy trì mẫu ở nhiệt độ thấp. Cần làm lạnh tốt mẫu và ống ly tâm trước khi ly tâm. Nếu trong máy có các ổ đệm thay thế có thể làm lạnh chúng trong tủ lạnh trước khi ly tâm. Cần phải tiến hành ly tâm với thời gian tối thiểu để tránh nóng máy. Có thể đặt trực tiếp máy ly tâm bé vào tủ lạnh, đưa dây dẫn ra ngoài qua lớp đệm của cánh cửa tủ lạnh.
4.2.2. Thẩm tích
Thẩm tích là sự khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chất keo hòa tan (protein, một số các polysaccharid) nhưng thấm đối với các dạng dịch các tinh thể.Các tinh thể (các muối, các hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp...) có thể khuếch tán qua màng theo định luật Fick. Nước sẽ khuếch tán từ dung dịch có nồng độ thấp hơn (thường là dung dịch rửa) vào dung dịch keo, trong khi đó các ion (cation và anion) và các chất phân tử nhỏ sẽ chuyển vào dung dịch có nồng độ thấp hơn (thường chuyển vào dung dịch rửa). Trong quá trình tách chiết và tinh sạch protein, để loại muối ammonium sulphate ra khỏi dung dịch protein thì cho dung dịch protein vào cái túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm. Thông thường người ta hay dùng túi colodion hoặc cellophane (loại sau hay được dùng hơn). Sau đó đặt cả túi vào bình chứa lượng lớn nước hoặc lượng lớn dung dịch đệm được pha loãng (ví dụ đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M). Vì màng cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ chỉ cho các chất có phân tử đi qua vào các dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán. Như vậy, muối sẽ khuyến tán vào nước hoặc dung dịch đêm loãng (di chuyển theo hướng giảm nồng độ), còn nước hoặc đệm loãng sẽ di chuyển từ dung dịch rửa vào túi chứa protein. Protein là những đại phân tử không thể vượt qua túi thẩm tích và được giử lại trong túi. Bằng cách thay đổi thường xuyên dung dịch rửa có thể tẩy sạch muối ra khỏi protein , mặc dầu trong quá trình thẩm tích, nó là dung dịch được pha loãng hơn. Có thể làm giảm bớt hoặc loại trừ sự pha loãng như thế khi tiến hành thẩm tích dưới áp suất, có nghĩa là khi dung dịch được xử lý nằm dưới một áp suất thủy tĩnh đầy đủ, để dòng thủy động học của nước từ dung dịch sẽ cân bằng sự khuếch tán của các phân tử vào dung dịch. Phương pháp này thường đòi hỏi có thiết bị đặc biệt.

<o></o>​

<v:shape id=_x0000_i1029 style="WIDTH: 176.25pt; HEIGHT: 123.75pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=5344f0221eaab06b.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image005.jpg"></v:imagedata></v:shape><o></o>​

Hình 5.1 Thẩm tích để loại muối (NH<SUB>4</SUB>)<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB> trong kết tủa protein.​

Phương pháp thẩm tích thông thường là cho dung dịch có kết tủa protein vào túi thẩm tích (không quá 2/3 thể tích túi). Cho thuốc sát trùng hoặc toluen để bảo quản protein (vì thời gian thẩm tích lâu, protein có thể bị thối hỏng). Buộc túi vào một que thủy tinh, gác que thủy tinh lên miệng chậu nước để giữ túi ở giữa chậu. Cho vòi nước chảy nhẹ liên tục vào đáy chậu để thay đổi nước thường xuyên (hình 5.1). Muối (NH<SUB>2</SUB>)SO<SUB>4</SUB> hòa tan trong nước và bị loại dần. Thời gian thẩm tích có thể từ 24 - 48 giờ, làm thẩm tích lần cuối cùng bằng nước cất.
Có thể tăng tốc độ thẩm tích khi khuấy dung dịch rửa bằng máy trộn cơ học hay máy trộn từ hoặc là quay chậm túi nhờ động cơ không lớn. Khi thẩm tích các protein thường người ta tiến hành tất cả các thao tác ở môi trường lạnh.
4.2.3. Sắc ký lọc gel
Sắc ký lọc gel là một trong những kỹ thuật sắc ký cột được dùng phổ biến trong tách chiết và tinh sạch protein.
Dịch chiết protein enzyme đã được loại bỏ phần lớn các protein tạp nhưng vẫn chưa đảm bảo độ đồng nhất cần thiết được tiếp tục làm sạch bằng phương pháp sắc ký cột. Phương pháp sắc ký (chromatography) là do hai chữ "chroma" là màu sắc và "grapho" là viết, nghĩa là viết bằng màu. Thuở ban đầu, người ta sử dụng phương pháp sắc ký để tách các chất màu và chỉ sau này người ta áp dụng cho việc tách các chất không màu.
Sắc ký lọc gel còn được gọi là phương pháp dùng chất rây phân tử, lọc gel (gel filtration)
Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau nhau về kích thước, hình dạng và phân tử lượng của protein enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra.
Để đảm bảo cho việc tách protein enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ, không phản ứng với protein enzyme. Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền với các yếu tố về cơ học cũng như sinh học. Ngoài ra chất được sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải là chất không có tính đàn hồi (không co) và phải là chất ưa nước (hidrofil).
Gel sephadex là chất thỏa mãn các yếu tố trên. Sephadex là chế phẩm dextran do các loài vi sinh vật khác nhau là Leuconostoc tạo ra khi chúng được nuôi cấy trên môi trường chứa saccharose. Trọng lượng phân tử của dextran có thể đạt tới hàng triệu và lớn hơn. Phân tử dextran bao gồm các chuỗi do các gốc glucose tạo thành các liên kết 1,6. Sephadex Nhận từ dextran bằng cách xử lý hóa học (do tác dụng của epichlohidrin) để tạo ra các lưới phân nhánh có liên kết ngang gọi là "sàng phân tử" và chất này trở thành không tan trong nước. Số liên kết ngang tạo ra càng nhiều, kích thước của lỗ sàng phân tử càng nhỏ.
Phương pháp lọc phân tử trên Sephadex được tiến hành như sau: cho sephadex vào cột thủy tinh dài và cân bằng bằng dung dịch đệm có pH nhất định. Sau đó cho dung dịch protein enzyme lên cột. Khi lọc và chiết bằng dung môi thích hợp, các phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ (ở đây là các muối) sẽ khuếch tán chậm chạp qua các lỗ nhỏ của các hạt Sephadex bị trương phồng, còn chất có trọng lượng phân tử lớn hơn (ở trường hợp này là protein enzyme) không có khả năng đi vào mà lách nhanh qua các hạt sephadex và sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột (hình 5.2 và hình 5.3). Vì vậy ta có thể tách được chất có trọng lượng phân tử cao hơn thoát ra khỏi cột gel trước so với chất có phân tử lượng nhỏ. Hãng Sephadex (Pharmacia) của Thụy Điển đã tung ra thị trường các loại sephadex có kích thước khác nhau có ký hiệu từ G10 đến G200. Số ký hiệu để chỉ ra mức độ nhận (hút) nước của chúng. Ví dụ G10 để chỉ khi trương phồng thì 1g gel khô nhận 1ml nước (1ml/g)

<v:shape id=_x0000_i1030 style="WIDTH: 354pt; HEIGHT: 199.5pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=b6c0fae68372f858.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image006.jpg"></v:imagedata></v:shape><o></o>​

Hình 5.2 Hoạt động của lọc phân tử sephadex.​

Các sephadex có ký hiệu khác nhau từ G10 đến G200 phục vụ trong việc lọc phân tử cho phép các chất có trọng lượng phân tử khác nhau lọt vào ở các ngưỡng khác nhau.
Người ta còn sử dụng sephadex để loại muối thay cho quá trình thẩm tích. Cùng nhóm chất rây phân tử có nguồn gốc polisacharid, là chế phẩm dextran như sephadex (pharmacia) còn có molselect (Reanal) - là sản phẩm của Hungary được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu.
Có thể dùng để làm cô đặc các chất có trọng lượng phân tử lớn như protein, peptid, loại muối khỏi protein enzyme (dùng nhanh hơn so với thẩm tích), lọc gel tách theo trọng lượng phân tử (như protein huyết thanh)

<o></o>​

<v:shape id=_x0000_i1031 style="WIDTH: 324pt; HEIGHT: 267pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=2f763a330ee20765.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image007.jpg"></v:imagedata></v:shape><o></o>​

Hình 5.3 Tách các phân tử theo kích thước bằng sắc ký lọc gel.​

hoặc tách các sản phẩm protein được hình thành dưới tác dụng của enzyme phân cắt (như g - G - globulin bị cắt bởi papain). Ngoài nhóm chất rây phân tử là chế phẩm dextran còn có nhóm chất rây phân tử là chế phẩm gel acrilamid bao gồm Biogel (Bio - Rad) và Acrilex (Reanal). Acrilex gel là loại copolimer, sản phẩm của Hungary được tạo ra từ acrilamid và N, N' - metilen bisacrilamid. Các acrilex gel có ký hiệu từ P - 300 dùng để tách các chất có trọng lượng phân tử trong ngưỡng từ 100 - đến 300.000. Có thể sử dụng ở vùng pH từ 2 - 11. Chất thứ ba là agarose gel, đã loại sulphate. Hay phổ biến là loại sepharose (Pharmacia). Người ta thường dùng chất này để tách các phân tử có trọng lượng lớn hơn 10<SUP>6</SUP>.
Tóm lại bằng phương pháp lọc rây phân tử người ta thể tách các chất có trọng lượng phân tử khác nhau có trong hỗn hợp (như polimer, polisaccharid, acid nucleic, protein). Người ta có thể dùng kỹ thuật này để loại muối thay cho quá trình thẩm tích. Và hơn thế nữa, trong quá trình tinh chế protein enzyme, chúng còn được sử dụng để cô đặc dung dịch protein enzyme.
4.2.4. Phương pháp sắc ký trao đổi ion.
Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của các protein enzyme. Hay nói cách khác, phương pháp này được dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion. Tác nhân (hay nguyên liệu) trao đổi ion có thể là chất nhựa có tích nhóm sinh ion hoặc là chất ionit. Đây là những chất giá trơ, không tan trong nước, có bản chất là cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex, Molselect) hoặc là chất nhựa polistirol. Chất giá thể này thường kết hợp với các nhóm ion hóa. Các chất trao đổi ion có chất giá là celluose, sephadex, molselect thông thường được dùng để tách protein enzyme, còn các chất trao đổi ion có chất giá là polistirol (ví dụ như Dowex, Amberlite) chỉ dùng để tách các peptid có trọng lượng phân tử nhỏ hơn.
* Các chất trao đổi ion có chất giá cellulose
- Cationit CM - cellulose (carboxylmetyl - cellulose)- là một dẫn xuất este của cellulose.
Cellelose - O - CH<SUB>2</SUB> - COOH
Khi phân li cho ra COO<SUP>-</SUP>. Đây là chất trao đổi cation.
Trên những cationit, thì các protein kiềm có thừa những nhóm amin và những nhóm kiềm khác được hấp phụ (liên kết ion). Sự hấp phụ trên các cationit được tiến hành với những dung dịch loãng ở pH 1,5 - 6,5. (Các protein kiềm có chứa các acid amin diamino - mono carboxylic như lys, Arg, His)
- Anionit DEAE - cellulose (diethylamino - ethyl - cellulose) là dẫn xuất este của cellulose)

<o></o>​

<v:shape id=_x0000_i1032 style="WIDTH: 226.5pt; HEIGHT: 31.5pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=42e1e8f49edfc87e.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image008.jpg"></v:imagedata></v:shape><o></o>​

Trong H<SUB>2</SUB>O nó được phân ly:

<o></o>​

<v:shape id=_x0000_i1033 style="WIDTH: 270.75pt; HEIGHT: 87pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=dd3fcf75bc82a822.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image009.jpg"></v:imagedata></v:shape><o></o>​

<v:shape id=_x0000_i1034 style="WIDTH: 0.75pt; HEIGHT: 0.75pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"> <v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=ccf32a38c42f1f28.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image010.gif"></v:imagedata></v:shape>
Đây là chất trao đổi anion, bản thân tích điện dương.
Các anionit được áp dụng để phân tích các protein acid có thừa những nhóm carboxyl tự do. Sự hấp phụ protein trên những ionit như vậy được tiến hành với những dung dịch đệm có lực ion thấp (0,005 - 0,1M) ở pH 7,5 - 8,5. (các protein acid có chữa các amino acid monoamin dicarboxylic như glu, Asp)
Trong hỗn hợp chất ionit với dung dịch đệm có độ pH tương ứng, các chất ionit đã nói ở trên trở nên tích điện. Vì vậy trên bề mặt lớp chất giá sẽ hình thành một lớp điện tích có dấu phụ thuộc vào kiểu nhóm chức hóa học của nó. Nếu thêm protein enzyme vào dung dịch đệm thì các phân tử protein enzyme mang điện tích sẽ bị các nhóm tích điện trái dấu của chất trao đổi ion kéo lại. Khi dùng một dung dịch đệm để phản hấp phụ có pH khác hoặc khi thêm một loại ion khác có lực ion lớn hơn thì phân tử protein enzyme sẽ bị đẩy ra khỏi chất trao đổi ion. Khi tiến hành phản hấp phụ, thường người ta thêm vào các ion Na<SUP>+</SUP> và Cl<SUP>-</SUP> trong NaCl có nồng độ tăng dần theo bậc thang hay theo gradient.
Các phân tử protein enzyme nào có điện tích tổng số nhỏ thì sẽ bị đẩy ra trước do lực liên kết với chất trao đổi ion yếu. Còn những protein enzyme nào có liên kết với ionit lớn hơn thì sẽ bị đẩy ra bằng một lực ion của muối lớn hơn. Như vậy, bằng cách này, chúng ta có thể tách được từng phần các loại protein enzyme. Việc tách từng phần có lựa chọn tốt nhất là khi tăng dần nồng độ các ion thay thế.
Nhờ nồng độ ion của muối tăng dần (gradient) người ta có thể rút ra từ cột các loại protein enzyme khác nhau. Có thể thu nhận dịch chiết enzyme protein sau khi qua cột bằng máy thu phân đoạn tự động. Theo thứ tự từng phần dịch thu được, người ta tiến hành định lượng protein theo các phương pháp Lowry hay phương pháp đo quang phổ và xác định đoạt hoạt độ của enzyme.
* Nếu chất giá là sephadex thì chúng ta có chất trao đổi ion sephadex. Đó là các loại DEAE - sephadex và CM - sephadex. Ưu điểm của loại này là vừa tách được protein enzyme về kích thước và về điện tích tổng số của các protein enzyme.
Trường hợp CM - sephadex trên chất giá sephadex có gắn nhóm COO<SUP>-</SUP>
<v:shape id=_x0000_i1035 style="WIDTH: 109.5pt; HEIGHT: 45.75pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"> <v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=9c148adabc9c81b3.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image011.jpg"></v:imagedata></v:shape>
COO<SUP>-</SUP>: mang điện tích âm ® là chất trao đổi cation
4.2.5. Phương pháp dùng chất hấp phụ đặc hiệu sinh học hay là phương pháp sắc ký ái lực (affinity Chromatography).
Cơ sở của phương pháp này là người ta gắn những phân tử gắn (ligand) vào chất mang (chất giá) rắn bằng liên kết cộng hóa trị mà protein enzyme cần tách sẽ tương tác đặc hiệu với nó. Những chất đó có thể là cơ chất (Substrate) hoặc chất ức chế (inhibitor) cạnh tranh. Trong trường hợp hai chất kháng nguyên và kháng thể có ái lực liên kết đặc hiệu với nhau, người ta thay thế vị trí chất gắn vào giá thể giữa kháng nguyên và kháng thể để nghiên cứu từng loại giống như cơ chất, chất ức chế và enzyme đặc hiệu của chúng. Hay nói cách khác dùng chất chỉ có khả năng liên kết đặc hiệu với một enzyme hoặc protein ta nghiên cứu. Chất mang thể rắn có thể là bất kỳ một loại nào phục vụ cho lọc gel như sephadex, nhưng người ta hay sử dụng nhất là gel Sepharose
Ở trên cột giá thể hay chất mang chứa cơ chất cố định ở pH và lực ion phù hợp, chỉ có protein enzyme nào có khả năng chuyển hóa cơ chất mới gắn vào, các protein khác thì chảy xuống cột. Bằng cách thay đổi pH và lực ion phù hợp hoặc có thể bằng cách thêm chất ức chế cạnh tranh đã được hòa tan vào thì có thể tách được protein enzyme khỏi cột ở trạng thái sạch.
4.2.6. Kết tinh protein.
Đây là phương pháp đặc hiệu tốt nhất để tách từng phần protein enzyme ở giai đoạn tinh chế cuối cùng.
Khi protein enzyme đã được làm tinh khiết hoàn toàn, trong những trường hợp riêng biệt, người ta có thể tiến hành kết tinh chúng. Một điều cần chú ý là protein enzyme ở trạng thái tinh thể không thể được coi là bằng chứng về sự tinh khiết. Các tinh thể protein enzyme kết tinh lần đầu đôi khi có độ sạch không vượt quá 50% và có thể chứa các protein enzyme khác. Người ta thường tiến hành kết tinh protein enzyme trong dung dịch (NH<SUB>4</SUB>)<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB>. Quá trình kết tinh có thể tiến hành từ từ kéo dài vài ngày thậm chí hàng tuần nếu muốn nhận được các tinh thể tốt. Thông thường là thêm muối (NH<SUB>4</SUB>)<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB> vào dung dịch protein enzyme khá đậm đặc cho đến khi làm vẫn đục nhẹ nhàng dung dịch. Sau đó đặt dung dịch vào một nơi, đồng thời tăng rất từ từ nồng độ muối trong dung dịch. Có thể tiến hành tăng nồng độ muối theo nhiều cách, thêm dung dịch muối đậm đặc hơn vào dung dịch protein enzyme theo từng giọt, thêm muối qua màng bán thấm hoặc có thể cho bay hơi chậm chạp dung dịch protein enzyme. Trong quá trình kết tinh có thể thay đổi chỉ số pH hoặc nhiệt độ. Để kết tinh protein enzyme được dễ dàng, ở những giai đoạn trước đó, người ta thường tách từng phần các protein enzyme bằng các dung môi hữu cơ. Điều này có lẽ liên quan đến việc các chất cơ bản, chất lipid bị loại ra khỏi dung dịch protein enzyme tạo điều kiện tốt cho quá trình kết tinh.
4.2.7. Làm khô và bảo quản chế phẩm protein.
Tính cố định cấu trúc của protein được bảo đảm nhờ khả năng liên kết nước của chúng. Nếu dung dịch protein enzyme bị khô ở độ nhiệt trong phòng thì đa số protein enzyme bị biến tính. Protein enzyme chỉ có thể được giữ ở dang khô trong trường hợp nếu việc sấy khô được tiến hành vô cùng nhanh hoặc ở nhiệt độ thấp. Nhiều protein như chúng ta đã biết, ở độ nhiệt thấp có thể được kết tủa bằng rượu hoặc acetone. Nếu kết tủa thu được bằng cách đó đem xử lý bằng rượu tuyệt đói, bằng acetone hoặc bằng ether và sau đó làm khô thật nhanh thì protein sẽ không bị biến tính. Ở dạng khô, bột protein có thể giữ một thời gian lâu, khi hòa tan nó trong nước nó thể hiện những tính chất ban đầu của mình.
Tuy nhiên, nhiều protein không chịu được cách xử lý như vậy. Vì vậy, người ta sử dụng phương pháp làm đông khô là phương pháp làm khô protein thận trọng nhất, phương pháp này có thể sử dụng được cho hầu hết protein.
Dung dịch protein đã được thẩm tích được làm đóng băng và làm thăng hoa băng ở áp suất 0,01-0,001 mm thuỷ ngân (được tạo ra nhờ máy hút chân không mạnh). Nơi nước được tạo ra đều được đóng băng trong bầu dự trữ ở độ nhiệt thấp hơn (-70, -80<SUP>o</SUP>C). Sau một vài giờ chỉ còn lại bột protein. Sau đó bột này (trong chân không) có thể được giữ ở độ nhiệt cao hơn. Protein đã được làm đông khô bằng cách như thế khi hoà tan trong nước cất sẽ cho dung dịch protein (nguyên thể) ngay sau một vài năm. Người ta đã bảo quản huyết thanh máu bằng phương pháp như thế, huyết thanh khô này có thể được sử dụng trong mục đích truyền máu.
V. Định lượng và đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm protein
5.1. Các phương pháp xác định hàm lượng protein
Protein sau khi đã được tách chiết và làm sạch có thể định lượng được. Nếu protein nghiên cứu là enzyme thì việc định lượng thông qua xác định hoạt độ của enzyme (theo quy ước quốc tế: 1 đơn vị hoạt độ enzyme là lượng enzyme làm chuyển hoá 1mmol cơ chất trong 1 phút ở các điều kiện tiêu chuẩn). Như vậy cứ sau các bước tách chiết và làm sạch protein người ta thấy tổng lượng protein giảm nhưng hoạt độ enzyme tăng nghĩa là hoạt độ riêng tăng rất cao. Protein được coi là sạch nếu những bước tách chiết và làm sạch sau không làm tăng hoạt độ riêng của chúng nữa, và chỉ khi đó ta mới hoàn thành việc tách chiết và làm sạch protein. Nếu protein không phải là enzyme thì ta có thể định lượng chúng bằng các phương pháp khác. Nếu protein ta nghiên cứu là hormon hoặc các độc tố thì chúng được xác định qua hiệu ứng sinh học mà chúng gây ra; ví dụ như hormon sinh trưởng (growth hormone) sẽ kích thích sự sinh trưởng của các tế bào đích nuôi cấy. Nếu là protein vận chuyển thì có thể xác định chúng thông qua nồng độ chất mà chúng vận chuyển. Sau đây là một số phương pháp thường được sử dụng để xác định hàm lượng protein.
- Định lượng nitrogen theo phương pháp kjeldahl:
Phần lớn các phương pháp gián tiếp xác định protein đều dựa trên cơ sở xác định lượng nitrogen. Lượng nitrogen có trong các protein là gần giống nhau không phụ thuộc vào chất lượng và nguồn protein. Đương nhiên trên cơ sở lượng nitrogen có thể xác định chỉ các protein đã được tinh sạch hoặc lượng protein của các mẫu nghiên cứu mà ngoài protein ra không chứa những chất chứa nitrogen khác. Trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, protein thô được định lượng bằng cách xác định lượng nitrogen toàn phần và kết quả nhân với 6,25, nghĩa là coi protein luôn luôn chứa 16% nitrgen. Thực tế, trong thực phẩm, bên cạnh protein còn có những chất hữu cơ khác có chứa nitrogen như amid, alcaloid, ammonia (ví dụ như trong thực phẩm lên men) acid nitric... do đó hàm lượng nitrogen toàn phần chính thức cao hơn 16% (16-17%) nhưng ở protein thực vật thì hàm lượng này lại thấp hơn 16%. Hệ số 6,25 là hệ số trung bình thô. Trong một vài trường hợp, muốn có kết quả chính xác, nên dùng những hệ số đặc biệt.
Nguyên lý của phương pháp này là vô cơ hoá mẫu bằng H<SUB>2</SUB>SO<SUB>4</SUB> đậm đặc và chất xúc tác. Dùng một kiềm mạnh (NaOH hoặc KOH) đẩy NH<SUB>3</SUB> từ muối (NH<SUB>4</SUB>)<SUB>2</SUB>SO<SUB>4. </SUB>Sau đó hứng NH<SUB>3</SUB> vào dung dịch acid có nồng độ xác định. Sau đó dùng kiềm có nồng độ xác định để chuẩn độ acid dư. Từ đó tính được lượng nitrogen có trong nguyên liệu.
- Định lượng protein theo phương pháp Lowry:
Phương pháp này dựa trên cơ sở dùng máy đo màu để xác định màu sản phẩm khử của phosphomolipden - phosphowolframate (thuốc thử Folin - Ciocalteau) với phức hợp đồng - protein. Phức màu xanh tạo thành có thể đo ở bước sóng 675nm. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ protein. Dựa vào đồ thị chuẩn protein (thông thường dùng tinh thể albumin huyết thanh bò) ta có thể tính được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.
Phương pháp Lowry được dùng rộng rãi để xác định nhiều loại protein khác nhau. Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép phát hiện được protein trong dung dịch ở nồng độ 1mg/ml. Tuy nhiên cường độ màu còn tuỳ thuộc nhiều vào loại protein. Ví dụ, ở cùng một nồng độ, dung dịch trypsin cho cường độ màu cao gấp 3 lần gelatin, hemoglobin cho cường độ màu thấp hơn trypsin nhưng cao hơn gelatin.
Ngoài ra, nhiều chất khác có thể làm tăng hay giảm cường độ màu phản ứng, vì vậy phương pháp này cho kết quả chính xác khi xác định protein đã được tinh sạch.
- Định lượng protein bằng phương pháp quang phổ:
Phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protein trong dung dịch là độ hấp thụ tia cực tím của nó. Nếu protein tinh sạch thì nồng độ tuyệt đối của nó được tính theo giá trị đo được. Nếu protein không tinh sạch (ví dụ, dịch chiết từ một sắc ký) thì nồng độ của protein tổng được tính tương đối từ độ hấp thụ. Nguyên tắc của phương pháp này là các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bước sóng 280nm do các acid amin thơm như tryptophan, tyrosine và phenylalanine. Độ hấp thụ ở 280nm thay đổi tuỳ loại protein nhưng hệ số tắt đo được (nghĩa là độ hấp thụ của dung dịch protein 1% với đường sóng truyền qua 1cm) cho mỗi protein cho phép tính nồng độ của protein tinh sạch.
Với một hỗn hợp các protein hoặc với bất cứ một loai protein nào mà không biết hệ số tắt thì nồng độ protein được tính như sau:
Nồng độ protein (mg/ml)=1,55xA<SUB>280</SUB>-0,77xA<SUB>260</SUB>
Trong đó: A<SUB>280</SUB>: độ hấp thụ ở bước sóng 280nm
A<SUB>260</SUB>: độ hấp thụ ở bước sóng 260nm
Phương pháp này không dùng được cho các dung dịch có nồng độ protein thấp hơn 0,1mg/ml hoặc khi có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng một vùng cực tím (ví dụ, đệm, acid nucleic và một số chất béo), hoặc khi protein ở trong dịch truyền phù chứ không phải trong dung dịch. (Ví dụ, trong màng hoặc các phức hợp có trọng lượng phân tử lớn). Cũng cần chú ý là nếu tỷ lệ A<SUB>280</SUB>/A<SUB>260</SUB> thấp hơn 0,6 nghĩa là dung dịch protein chưa sạch, bị lẫn các chất khác, đặc biệt với acid nucleic thì nên sử dụng phương pháp Lowry để đo nồng độ protein.
Vì vậy, phương pháp đo độ hấp thụ tia cực tím thường được dùng để định lượng protein đã tinh sạch hoặc để xác định protein trong các phân đoạn nhận được khi sắc ký tách các protein qua cột.
5.2. Đánh giá tính đồng thể của protein:
Khi đã nhận được một protein enzyme ở trạng thái kết tinh, người ta phải thử lại mức độ tinh khiết hay tính đồng thể của nó. Độ đồng thể của chế phẩm protein enzyme phải được kiểm tra bằng một số phương pháp dựa trên những nguyên lý khác nhau. Trong một số trường hợp protein enzyme được coi là đồng thể khi ly tâm, nhưng lại có thể phân chia thành một số isoenzyme bằng phương pháp điện di trên gel. Chính vì vậy, nếu dùng nhiều loại phương pháp khác nhau để kiểm tra độ sạch của protein mà kết quả đều cho là đồng thể thì protein đó có thể được công nhận là tinh khiết. Những phương pháp để kiểm tra tính đồng thể hay dùng là xây dựng đồ thị về độ hoà tan, điện di và siêu ly tâm.
- Phương pháp kiểm tra tính đồng thể (hoặc còn gọi là tính đồng nhất) của protein đơn giản và nhạy nhất là xây dựng đường biểu diễn về độ hoà tan.
Cách làm như sau: Trong hàng loạt mẫu dùng một thể tích không đổi một loại dung môi (nước hoặc dung dịch muối) lắc với những số lượng enzyme khác nhau. Sau đó lọc và xác định số protein trong dịch lọc. Cuối cùng xây dựng đường đồ thị.
Trong những loại mẫu đầu, tất cả các protein thêm vào bị hoà tan và số lượng protein thêm vào bằng số lượng protein có trong dịch lọc hay dịch ly tâm. Kết quả nhận được biểu diễn là một đường thẳng. Sau đó dung dịch đạt được bão hoà. Nếu protein đem hoà tan là tinh khiết nghĩa là đồng nhất thì khi thêm protein trong dịch lọc sẽ không tăng lên và đường biểu diễn có một điểm uốn. Nếu trong mẫu có một protein thứ hai thì sau khi đạt được độ bão hoà đối với protein ít hoà tan hơn, loại protein thứ hai còn có thể hoà tan được nữa.
Kết quả là có một điểm bão hoà thứ hai và đường biểu diễn có hai điểm uốn. Nếu dịch chiết (hỗn hợp) có nhiều protein enzyme thì sẽ có nhiều điểm uốn. Phương pháp này được Northrop và Kunitz sử dụng rất có kết quả. Nay vẫn còn ứng dụng nhiều.
- Phương pháp thứ hai để xác định độ đồng thể của protein enzyme là phương pháp điện di. Phương pháp điện di là ứng dụng tính chất lưỡng tính của protein, dựa trên cơ sở dịch chuyển của các tiểu phần chế phẩm protein enzyme mang điện trong điện trường. Đem chế phẩm protein enzyme điện di ở pH và lực ion nhất định. Nếu trên điện di đồ có một băng protein thì chứng tỏ protein enzyme đó là đơn thể. Nếu có hai băng chứng tỏ có hai protein enzyme trong chế phẩm đó. Bản điện di đồ này được đua vào máy detector để phát hiện không chỉ nồng độ của băng điện di mà còn phát hiện được số lượng các băng vệt.

<o></o>​

<v:shape id=_x0000_i1036 style="WIDTH: 309.75pt; HEIGHT: 234pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=c86f06bec2e69ac9.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image012.jpg"></v:imagedata></v:shape><o></o>​

Hình 5.4: Đường biểu diễn độ hoà tan protein​

- Phương pháp siêu ly tâm:
Đây cũng là phương pháp rất quan trọng để xác định tính đồng thể của protein enzyme. Phương pháp được thực hiện như sau:
Dùng lực ly tâm rất lớn bằng cách tăng số vòng quay ly tâm lên hàng nghìn, hàng vạn vòng trong một phút. Với tốc độ ly tâm rất lớn, người ta có thể tách ra được các phân tử enzyme có trọng lượng phân tử khác nhau.
Tốc độ kết tủa của protein enzyme trong máy siêu ly tâm được xác định bằng trọng lượng phân tử của nó. Khi dừng quay thì các phân tử protein lại khuyếch tán vào dung dịch. Bởi vậy, cần phải quan sát tốc độ lắng trong quá trình siêu ly tâm. Chính vì vậy, trong cốc siêu ly tâm, người ta gắn một thiết bị quang học đặc biệt, vẽ các đường ánh sáng của kết quả phân tích lên một màn. Nếu trong dung dịch có một loai protein enzyme (có một trọng lượng phân tử) thì trên màn sáng sẽ cho đường đồ thị có một đỉnh. Nếu làm việc với hai protein enzyme thì sẽ có hai đỉnh v.v...

TÀI LIỆU THAM KHẢO​

1. Nguyễn Hữu Chấn, Nguyễn Thị Hà, Nguyễn Nghiêm Luật, Hoàng Bích Ngọc, Vũ Thị Phương. 2001. Hoá sinh. Nxb Y học - Hà Nội.
2. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng. 1999. Hoá sinh học.Nxb Giáo dục - Hà Nội.
3. Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên. 1998. Giáo trình sinh hoá hiện đại. Nxb Giáo dục - Hà Nội.
4. Lê Ngọc Tú, Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẫn, Lê Doãn Diên. 2002. Hoá sinh công nghiệp. Nxb Khoa học & Kỹ thuật - Hà Nội.
5. Ajtai K., Szilagyi L..1985. Biokémiai gyakorlatok.Tankonyv. Jankonyv Kiado, Budapest.
6. Kerese I. 1984 Methods of Protein analysis. Akademiai Kiado, Budapest
7. Lehninger A.L. 2004. Principles of Biochemistry, 4<SUP>th</SUP> Edition. W.H Freeman, 2004
8. Stryer l., 1981. Biochmistry. W. H. Freeman and company, San francisco.
VI. Các quá trình tách chiết và tinh sạch protein
Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protein, đặc biệt là các enzyme, đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Phần lớn enzyme sử dụng trong công nghiệp là các protein ngoại bào từ các cơ thể như Aspergillus sp. và Bacillus sp., bao gồm: a-amylase, b-glucanase, cellulase, dextranase, protease và glucoamylase. Nhiều loại trong số này vẫn còn được sản xuất từ các chủng gốc tự nhiên của vi sinh vật. Tuy nhiên, trong sản xuất protein để sử dụng ở các lĩnh vực chẩn đoán lâm sàng và cho các ứng dụng trị liệu, công nghệ protein và công nghệ DNA tái tổ hợp đã thể hiện một vai trò ngày càng quan trọng. Công nghệ DNA tái tổ hợp, ngoài việc cho phép cải thiện hiệu suất cao, nó cũng cho phép chuyển các vật liệu di truyền từ động vật vào vi khuẩn vật chủ. Theo phương thức này, các protein vốn chỉ có một lượng nhỏ từ mô động vật bây giờ có thể được sản xuất trong một lượng gần như vô hạn từ các vi khuẩn sinh trưởng dễ dàng. Một ví dụ điển hình là hormone sinh trưởng người, chất này được sản xuất mỗi lần với một lượng rất nhỏ từ tuyến yên của người cho đến khi nó được thừa nhận hiện diện một rủi ro tiềm tàng đối với bệnh nhân từ sự nhiễm bẩn prion là yếu tố được ám chỉ trong hội chứng Creutzfeld-Jacob. Hormone sinh trưởng người bây giờ được sản xuất với một lượng lớn hơn rất nhiều từ vi khuẩn E. coli và nó hoàn toàn sạch không bị nhiễm prion không mong muốn.
Các protein hoặc enzyme được sản xuất bằng vi sinh vật có thể ở nội bào, ở khoang gian bào hoặc tiết vào môi trường nuôi cấy. Đối với các enzyme ngoại bào, mức độ tinh sạch cần thiết thường là tối thiểu, khi sản phẩm cuối cùng được dùng trong công nghiệp và không cần độ tinh sạch cao. Các quá trình quy mô lớn như thế có thể cho sản lượng protein lên đến hàng tấn.
Nhiều loại protein khác được sản xuất trong các hỗn hợp nội bào phức tạp đã gây ra nhiều khó khăn trong quá trình tinh sạch chúng. Những protein đòi hỏi phải tinh sạch này thường được sản xuất để sử dụng trong điều trị, do đó phải cố gắng hướng tới các tiêu chuẩn tinh sạch rất cao, và để có được điều này người ta cần phải phát triển các quy trình tinh sạch phức tạp. Một lần nữa, công nghệ DNA tái tổ hợp đã có đóng góp hiệu quả trong lĩnh vực này. Trong trường hợp các protein trị liệu, thường có những thuận lợi nếu protein quan tâm có thể được tiết hoặc vào khoảng gian bào hoặc vào trong môi trường. Điều này giúp giảm rất lớn độ nhiễm bẩn của protein và các đại phân tử khác, sản phẩm tinh sạch như thế thường thu được chỉ trong hai hoặc ba bước tinh sạch. Chọn lựa hệ thống biểu hiện thích hợp có thể cho hiệu quả cao hơn trong hệ lên men, có liên quan tới việc cải thiện hoạt tính đặc biệt của nguyên liệu khởi đầu. Cũng có khả năng bổ sung các nhóm chức vào protein để giúp cho sự tinh sạch, tạo ra cho nó các tính chất đặc biệt và sau đó loại bỏ các nhóm chức này khi chúng không được yêu cầu lâu hơn.
Trong thiết kế quy trình tinh sạch ở quy mô lớn thì số lượng các bước, và sự thu hồi sản phẩm ở mỗi bước đã ảnh hưởng quan trọng lên sản lượng toàn phần. Sự thu hồi đặc trưng của một bước sắc ký là trong khoảng 80% và 90%, vì sự tinh sạch phức tạp đòi hỏi nhiều bước do đó sản lượng toàn phần nhiều khi chỉ bằng 10% của nguyên liệu khởi đầu. Điều này không thành vấn đề ở trường hợp tinh sạch quy mô phòng thí nghiệm, nhưng nếu tinh sạch ở quy mô lớn thì đó là vấn đề rất quan trọng cần quan tâm để tối ưu toàn bộ quá trình từ hệ thống biểu hiện hoặc sự lên men đến bước tinh sạch cuối cùng, để giảm thiểu số bước tinh sạch cần thiết.

1. Thu hồi protein
Sự thu hồi và tinh sạch các protein và enzyme cũng quan trọng như các giai đoạn lên men xét theo góc độ kinh tế của quá trình sản xuất. Thách thức chính trong các bước thu hồi là giảm thiểu sự mất hoạt tính của protein. Trong phần này sẽ trình bày các bước thu hồi và tinh sạch truyền thống cho protein.

1.1. Thu hồi các protein ngoại bào
Các protein ngoại bào tương đối dễ thu hồi và tinh sạch. Tế bào và nồng độ của dung dịch hoạt động được loại bỏ một cách đơn giản, và có thể cung cấp trực tiếp protein thô thích hợp cho một số ứng dụng.
Dung dịch protein tương đối sạch có thể thu được bằng cách cho các nuôi cấy sinh trưởng trên môi trường đơn giản có thành phần xác định. Các bước thu hồi và tinh sạch giống như các bước đã dùng cho protein nội bào sau khi phá vỡ tế bào.

1.2. Thu hồi các protein nội bào
Để tách chiết các protein nội bào từ các nguồn động-thực vật, mô phải được phá vỡ để giải phóng chúng.

1.2.1. Phá vỡ tế bào
a. Nguyên lý chung
Làm khô mô là phương pháp thuận lợi để ổn định và phá vỡ tế bào động-thực vật. Phương pháp đông khô không thích hợp để phá vỡ mô nhưng tránh được sự đứt gãy protein, mặc dù nó vô cùng đắt trong sản xuất quy ở mô lớn. Mô có thể được làm khô trong điều kiện chân không hoặc trong không khí, hoặc kết tủa bằng dung môi trộn với nước. Sau đó, thu dịch chiết enzyme từ các nguyên liệu khô bằng cách hydrate hóa trở lại nguyên liệu trong một dung dịch đệm thích hợp. Phương pháp đông lạnh đơn giản cũng có tác dụng phá vỡ một ít mô, mặc dù đây là phương pháp không thích hợp cho việc tăng quy mô sản xuất.
Một số nguyên liệu động-thực vật cần có quá trình đồng hóa trước đó, sao cho mô được phá thành những mảnh nhỏ và trộn lẫn với nhau, sau đó sử dụng phương pháp cơ học để phá vỡ tế bào. Một khi protein được hòa tan, các vỏ tế bào chết được loại bỏ dễ dàng bằng phương pháp lọc. Ly tâm tốc độ thấp cũng có thể được sử dụng. Ở một số mô có sự hiện diện của chất béo, việc loại bỏ lớp chất béo bằng ly tâm gặp nhiều khó khăn. Các chất béo chỉ được loại bỏ dễ dàng bằng tách chiết dung môi; kết tủa acetone là phương thức thích hợp để tách protein ra khỏi các nguyên liệu lipid. Một phương thức khác là các dung môi trộn nước như hexane, cũng có thể được sử dụng.
Phá vỡ các tế bào vi sinh vật thường gặp nhiều khó khăn hơn các tế bào động thực vật. Các tế bào vi sinh vật thường dai hơn và có kích thước nhỏ (khoảng 0,2-10 µm) nên phải có phương pháp phá vỡ đặc biệt. Nhiều enzyme từ nấm men và các vi khuẩn Gram âm có thể được chiết bằng cách dùng các dung môi không trộn nước, như toluen hoặc chloroform, có thể phá vỡ màng tế bào và giải phóng enzyme. Các dung môi hòa tan nước, như ethanol và 2-propanol, được dùng để tách chiết enzyme từ khoảng gian bào, nhưng sử dụng các dung môi này đòi hỏi mức độ an toàn cao trong sản xuất ở quy mô lớn. Các chất tẩy thích hợp có thể được dùng để tách chiết các phân tử enzyme nhỏ (khối lượng phân tử dưới 70.000 Da).
Trong một số trường hợp enzyme ổn định ở giá trị pH cao, có thể sử dụng dung dịch kiềm để phân giải các tế bào vi khuẩn. Thành tế bào vi khuẩn được phân giải bằng lysozyme, tuy nhiên giá thành của enzyme này là rất cao. Tương tự, nấm men có thể được phân giải bằng β-glucanase. Hiện tượng tự phân giải có thể xuất hiện trong nấm men, nhưng cần có thời gian dài vì thế sẽ gây khó khăn khi điều chỉnh hoặc tối ưu quá trình lên men.
Các tế bào vi sinh vật có thể được phá vỡ dễ dàng hơn bằng các phương thức vật lý. Siêu âm là kỹ thuật thích hợp và rất hiệu quả ở quy mô phòng thí nghiệm, nhưng khó ứng dụng ở quy mô sản xuất lớn. Phá vỡ tế bào bằng cách dùng áp suất cao để đẩy nguyên liệu (dịch huyền phù tế bào dưới dạng bột nhão được làm đông ở -20<SUP>o</SUP>C) qua các lỗ hẹp của máy nén thì tế bào sẽ bị phá vỡ do sự thay đổi pha và thay đổi thể tích cũng như do lực cắt của các tinh thể đá. Phương pháp này có thể sử dụng để phá vỡ các tế bào nuôi cấy ở quy mô lớn 100-1.000 L/giờ. Nhiều loại tế bào có thể bị phá vỡ bằng khuấy (rung) nhanh hoặc trộn lẫn với các hạt thủy tinh nhỏ hoặc các hạt gốm (ceramic). Ở quy mô phòng thí nghiệm, phương thức này rất thích hợp. Ở quy mô sản xuất lớn người ta sử dụng phương pháp nghiền bằng quả cầu thép. Tỷ lệ và hiệu suất giải phóng enzyme phụ thuộc vào vận tốc lắc và kích thước của các loại hạt cũng như đường kính của thiết bị. Với cùng một thể tích hạt thì sử dụng một lượng lớn các hạt nhỏ sẽ hiệu quả hơn một lượng tương đối nhỏ các hạt lớn, vì nó làm tăng sự va chạm giữa các hạt và các tế bào.
Có ba phương pháp chính để giải phóng các protein nội bào khỏi vi sinh vật đó là phương pháp enzyme, hóa học và vật lý. Tuy nhiên, không phải tất cả các kỹ thuật có sẵn là thích hợp để sử dụng trên quy mô lớn. Ở quy mô lớn, người ta thường gặp khó khăn trong việc thiết kế công suất cần thiết cho thể tích lớn và loại bỏ nhiệt được sinh ra trong quá trình phá vỡ tế bào.

b. Các phương pháp enzyme
Lysozyme, một enzyme được sản xuất thương mại từ lòng trắng trứng gà, thủy phân các liên kết b-1,4-glycosidic trong mucopeptide của thành tế bào vi khuẩn. Các vi khuẩn Gram dương có thành tế bào rắn chắc nhờ vào mucopeptide là loại mẫn cảm với lysozyme nhất. Khi phân giải vi khuẩn Gram âm, ít khi người ta sử dụng một mình lysozyme, mà thường bổ sung thêm EDTA để tạo chelate với các ion kim loại sẽ dễ dàng làm tan tế bào (lysis). Mặc dù quá trình thao tác đơn giản và nhẹ nhàng, nhưng kỹ thuật này không được sử dụng cho việc tách chiết ở quy mô lớn các enzyme của vi khuẩn, vì lẽ do giá thành tương đối cao của lysozyme và khả năng đưa vào các tác nhân gây nhiễm bẩn. Chỉ có trường hợp người ta dùng lysozyme ở quy mô lớn là để giải phóng aryl acylamidase khỏi Pseudomonas fluorescens.

c. Các phương pháp hóa học để phân giải tế bào
- Xử lý kiềm. Xử lý bằng kiềm đã được sử dụng thành công trong tách chiết ở quy mô nhỏ và lớn các protein vi khuẩn. Ví dụ enzyme trị liệu, L-asparaginase, có thể được giải phóng khỏi Erwinia chrysanthemi bằng cách ủ tế bào ở pH từ 11-12,5 trong 20 phút. Thành công của phương pháp này là nhờ vào khả năng ổn định của sản phẩm mong muốn. Giá trị pH cao có thể làm bất hoạt protease.
- Chất tẩy rửa. Các chất tẩy, hoặc là ion ví dụ như sodium lauryl sulphate hay còn gọi là sodium dodecyl sulphate, sodium cholate (anion) và cetyl trimethyl ammonium bromide (cation) hoặc không phải ion như Trixton X-100, X-450 và Tween, được dùng để phân giải tế bào, thường có phối hợp với lysozyme. Các chất tẩy ion có hoạt tính mạnh hơn các chất tẩy không phải ion, và có thể dẫn đến sự biến tính của nhiều protein. Sự hiện diện của các chất tẩy cũng có thể ảnh hưởng đến các bước tinh sạch tiếp theo, đặc biệt kết tủa muối. Điều này có thể được khắc phục bằng cách sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion hoặc siêu lọc.

d. Các phương pháp vật lý để phân giải tế bào
- Shock thẩm thấu. Shock thẩm thấu cũng được dùng để giải phóng enzyme và protein khỏi khoảng gian bào của đa số vi khuẩn Gram âm. Phương pháp này bao gồm rửa tế bào trong dung dịch đệm để làm sạch chúng khỏi môi trường dinh dưỡng, và sau đó tạo dịch huyền phù trong môi trường ưu trương sucrose 20%. Sau khi đạt tới sự cân bằng thẩm thấu, tế bào được thu hồi và tái huyền phù nhanh trong nước ở khoảng 4<SUP>o</SUP>C. Trung bình chỉ khoảng 4-8% protein tổng số của vi khuẩn được giải phóng bởi shock thẩm thấu, nhưng nếu enzyme mong muốn hiện diện trong khoang gian bào thì có cho phép tách chiết một lượng lớn hơn từ 14-20 lần và rất sạch so với các kỹ thuật tách chiết khác.
Kỹ thuật shock thẩm thấu rất nhẹ nhàng và không làm biến tính các protein, nhưng do có nhiều vi sinh vật chống chịu được shock thẩm thấu nên người ta chỉ sử dụng nó cho các vi khuẩn Gram âm (ví dụ như E. coli) để tách chiết các enzyme thủy phân có trong khoang gian bào. Tuy nhiên, có ba lý do đã hạn chế áp dụng shock thẩm thấu ở quy mô lớn, đó là: thể tích làm việc lớn (400 dm<SUP>3</SUP> cho 10 kg bột nhão tế bào), nhiều giai đoạn ly tâm, và luôn phải duy trì ở nhiệt độ thấp.
- Nghiền. Trước đây kỹ thuật này có nhiều hạn chế khi nghiền hỗn hợp bột nhão của tế bào trong cối với bột gây xướt, như là bông thủy tinh, alumina hoặc đất tảo cát (kieselguhr). Sau đó, người ta đã phát triển bằng cách sử dụng các máy nghiền ẩm. Một sản phẩm đặc trưng là Dynomill (WA Bachofen, Switzerland) có thể được dùng để giải phóng protein khỏi rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau. Nó bao gồm một buồng chứa các hạt thủy tinh và các đĩa khuấy quay tròn. Dịch huyền phù tế bào được bơm vào buồng, sau đó khuấy nhanh đủ để phá vỡ thậm chí cả các tế bào vi khuẩn dai nhất. Buồng phân hủy phải được làm lạnh để loại bỏ sự sinh nhiệt. Một mô hình quy mô phòng thí nghiệm, với buồng 600 mL có thể thực hiện tới 5 kg vi khuẩn trên một giờ, và các mô hình ở quy mô sản xuất thích hợp với buồng có thể tích lên tới 250 L.
Một số nhân tố có thể ảnh hưởng đến tỷ lệ tế bào bị phá vỡ, như là kích thước và nồng độ của các hạt thủy tinh, loại, nồng độ và tuổi của tế bào, tiền xử lý hóa chất, tốc độ khuấy, tốc độ dòng chảy qua buồng, nhiệt độ, và sự sắp xếp của các đĩa khuấy, và những yếu tố này đã được khảo sát ở nấm men và vi khuẩn.
- Trượt rắn. Phương pháp phá vỡ tế bào bằng trượt rắn đã được dùng khá lâu ở quy mô nhỏ. Nguyên tắc của phương pháp này là đẩy nguyên liệu tế bào đã đông lạnh qua một lỗ hẹp ở áp suất cao và một nhiệt độ thoát ra ngoài khoảng -20<SUP>o</SUP>C. Phương pháp này ít được sử dụng ở quy mô công nghiệp, do nó không thể dùng một lượng lớn nguyên liệu để phá vỡ tế bào.
- Trượt lỏng. Trượt lỏng là kỹ thuật được chọn lựa để phá vỡ các tế bào vi sinh vật ở quy mô lớn, được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong cả hai: các quá trình công nghiệp và nghiên cứu. Phương pháp này đặc biệt thuận lợi cho phá vỡ tế bào vi khuẩn và nấm men.
Tương tự như phương pháp trượt rắn, các tế bào trong dịch huyền phù được chuyển qua một lỗ hẹp nén dưới áp suất cao. Trường hợp ở quy mô nhỏ hơn, người ta sử dụng thiết bị French Press (Hình 6.7). Ở quy mô lớn thường dùng thiết bị đồng hóa (homogenizer) là loại được phát triển để tạo thể sữa trong công nghiệp bơ sữa. Nhiệt độ tăng lên ít nhất 10<SUP>o</SUP>C trong một rãnh đơn là thường xảy ra, vì thế cần phải làm lạnh dịch huyền phù tế bào trước khi đồng hóa. Thiết bị đồng hóa trượt lỏng thường được hoạt động ở độ ẩm tế bào khoảng 20%.
Trong trường hợp quy mô lớn thì thiết bị đồng hóa Manton-Gaulin (APV Ltd. Crawley, UK) được sử dụng rộng rãi nhất. Nó bao gồm một máy bơm kiểu piston có một van thoát hơi được hạn chế, có thể điều chỉnh áp suất hoạt động cần thiết, tới 95 MPa. Thiết bị đồng hóa Manton-Gaulin (Hình 6.8) loại nhỏ nhất, 15-8TA, có thể đưa nguyên liệu vào khoảng 50 L/giờ ở áp suất 55 MPa. Một phiên bản lớn hơn, loại MC-4, có thể đưa nguyên liệu vào 300 L/giờ cũng ở áp suất 55 MPa.

<o></o>​

<v:shape id=_x0000_i1037 style="WIDTH: 186pt; HEIGHT: 143.25pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=ebb62a6bfcf0454f.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image013.jpg"></v:imagedata></v:shape><o></o>​

Hình 6.8. Mặt cắt ngang của thiết bị đồng hóa Manto-Gaulin
Tốc độ phá vỡ tế bào và giải phóng protein phụ thuộc vào một số nhân tố như: loại tế bào, điều kiện lên men, nồng độ và tiền xử lý (chẳng hạn đông lạnh, vì các tế bào vi sinh vật thường dễ vỡ hơn nhiều nếu chúng được làm lạnh trước)... Người ta cũng nhận thấy rằng sự hiện diện của các thể vùi giúp cho các tế bào E. coli dễ dàng bị phá vỡ hơn.
Tỷ lệ protein giải phóng khỏi các tế bào nấm men có thể được mô tả bằng một phương trình được xây dựng dựa trên kinh nghiệm như sau:

<v:shape id=_x0000_i1038 style="WIDTH: 255.75pt; HEIGHT: 47.25pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=137ad88a3a6e0cdf.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image014.jpg"></v:imagedata></v:shape>​

Trong đó: R<SUB>m</SUB> là lượng protein hòa tan cực đại được giải phóng theo lý thuyết, R là lượng protein được giải phóng thực tế, K là hằng số phụ thuộc nhiệt độ, n là số rãnh (number of passes), P là áp suất ngược hoạt động và a là hằng số phụ thuộc vào cơ thể.
Giá trị của số mũ a khác nhau tùy thuộc vào cơ thể, đối với nấm men nó khoảng 2,9 và E. coli khoảng 2,0. Có nhiều ví dụ về việc sử dụng thiết bị đồng nhất Manton-Gaulin để phá vỡ tế bào vi sinh vật ở quy mô lớn. Chẳng hạn: b-galactosidase được giải phóng khỏi E. coli, và carboxypeptidase khỏi Pseudomonas spp. Một số lớn enzyme được phân lập từ vi khuẩn ưa nhiệt Bacillus stearothermophilus, bao gồm glycerokinase và một hexokinase đặc trưng glucose. Trong một quá trình nhất định, các điều kiện để phá vỡ tế bào phải được thiết kế tối ưu một cách cẩn thận, vì các biến thiên khác nhau trong mức độ phá vỡ tế bào và giải phóng protein có thể có các ảnh hưởng một cách ý nghĩa lên các bước tinh sạch tiếp theo.

1.2.2. Phân lập các enzyme hòa tan
Phương thức quan trọng để phân tách enzyme hòa tan nhanh và hiệu quả sau khi phá vỡ tế bào là làm lạnh, dùng dung dịch đệm thích hợp, và có sự hiện diện của các tác nhân bảo vệ enzyme như mercapthoethanol (cần thiết để ổn định một số dung dịch enzyme).
Thường các nhân tố ức chế protein phải được bổ sung để làm giảm ảnh hưởng phân hủy của protease. Các enzyme hòa tan có thể được thu thập bằng phương pháp lọc qua màng hoặc bằng cách ly tâm. Phương pháp sau tương đối dễ thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm với các lực ly tâm tốc độ cao. Các lực g cao như thế không thể đạt được ở các thiết bị quy mô sản xuất lớn. Các máy ly tâm lớn thường được cấu tạo từ các hợp kim titanium đắt tiền để chịu đựng các lực g cao, nhưng mặc dù thế chỉ có thể thu được các lực g không cao lắm mà thôi. Để khắc phục điều này, các chất kết tủa nucleoprotein và protein, như polyethyleneimine, được bổ sung vào các chất đồng hóa tế bào để kết bông các nguyên liệu không mong muốn và giảm thời gian lắng xuống nhanh hơn.
Sử dụng phương pháp lọc như dùng đất diatomit (diatomaceous earth), có thể là biện pháp thích hợp để thu được các enzyme hòa tan và phát triển dễ dàng ở quy mô lớn. Các phương thức bổ sung được cũng sử dụng để tăng tốc độ lọc. Thông thường một vài tác nhân kết tủa có thể được cùng sử dụng để giảm các bước tiếp theo của quá trình. Các phương tiện trợ lọc có thể được dùng để thu thập các tế bào hoàn chỉnh và cung cấp một kỹ thuật phá vỡ tế bào mà không dựa vào các thiết bị đồng hóa cơ học. Ví dụ các tế bào trong hỗn hợp lọc có thể được phân giải hóa học, enzyme hoặc phương thức vật lý bằng cách khuấy nhờ khả năng gây xước tế bào của diatomit. Các enzyme hòa tan được giải phóng có thể thu thập thuận lợi bằng phương pháp lọc đơn giản.
Siêu lọc là công nghệ rất toàn diện, dễ dàng cho quy mô lớn và, với sự chọn lựa chính xác độ xốp của màng, các enzyme có thể được thu thập một cách chọn lọc theo khối lượng phân tử của chúng. Đĩa và khung, và các sợi rỗng (hollow fibres) được sử dụng trong một thời gian dài. Các màng ceramic hiện nay đã được sử dụng phổ biến hơn do đặc điểm dễ làm sạch và dễ khử trùng của chúng, vì chúng có thể chịu được nhiệt độ cao dưới các điều kiện chất tẩy và độ kiềm cao.
Thường thì dung dịch enzyme hòa tan không yêu cầu xử lý thêm nữa ngoại trừ nồng độ, hoặc dưới áp suất giảm hoặc bằng phương pháp lọc màng, để sản xuất một dung dịch protein được cô đặc (10-50% chất rắn). Các chất ổn định như ammonium sulphate có thể được bổ sung nếu cần thiết. Các tá dược như lactose, dextrin cũng có thể được bổ sung với vai trò là các chất ổn định enzyme.

2. Tinh sạch sơ bộ
Tinh sạch protein là một bước rất cần thiết, tuy nhiên thường chỉ thực hiện đối với những protein có giá trị ứng dụng cao. Quy mô của quá trình tinh sạch sẽ quyết định sự chọn lựa kỹ thuật phân tách, vì một số kỹ thuật gặp nhiều khó khăn khi tiến hành trên quy mô lớn.

2.1. Loại bỏ các mảnh vỡ của tế bào
Sau khi phá vỡ tế bào, bước đầu tiên trong quá trình tinh sạch protein nội bào là loại bỏ các mảnh vỡ tế bào. Sự phân tách các vật rắn khỏi chất lỏng là hoạt động cơ bản rất quan trọng trong phân lập protein, và thường được tiến hành bằng phương pháp ly tâm hoặc lọc. Nhiều quy trình có bổ sung một lượng nhỏ DNase ở giai đoạn này, để phá vỡ thêm các chuỗi DNA có thể làm cho dịch chiết trở thành dạng sệt (gelatinous).

2.2. Ly tâm mẻ
Ly tâm mẻ thích hợp với các dung tích ly tâm trong khoảng từ nhỏ hơn 1 mL đến một vài lít, và có khả năng sử dụng một lực ly tâm (rotational centrifugal force, RCF) tương đối lớn lên tới 100.000´g (hằng số hấp dẫn). Tuy nhiên, để loại bỏ các tế bào vi khuẩn, mảnh vỡ tế bào và các kết tủa protein, thì lực ly tâm chỉ cần đạt khoảng 20.000´g. Nhiều thiết bị ly tâm loại này phù hợp cho các quá trình tách chiết ở quy mô trung bình.

2.3. Ly tâm dòng chảy liên tục
Ly tâm dòng chảy liên tục thường được sử dụng cho quá trình tinh sạch protein ở quy mô lớn để loại bỏ các chất dạng hạt. Có ba kiểu ly tâm chính thích hợp hơn cả là: ly tâm thùng rỗng (hollow bowl), ly tâm thùng có nhiều buồng (multi-chamber) hoặc đĩa (dics), và ly tâm thúng (basket).
- Ly tâm thùng rỗng. Bao gồm một rotor hình ống cung cấp một đường chảy dài cho dịch chiết được bơm vào trong đáy và chảy lên qua thùng. Chất lắng bị bắn vào thành của thùng, và dịch chiết được gạn sẽ chuyển lên để ra khỏi thùng vào trong bình thu. Khi ly tâm bắt đầu, đường kính thực tế của thùng giảm, vì thế đã làm giảm đường lắng và lực ly tâm. Tốc độ dòng chảy phải được xác định theo kinh nghiệm vì nó rất khác nhau giữa các loại dịch chiết, nhưng tốc độ dòng chảy thích hợp cho các máy lớn là khoảng 60 L/giờ.
- Ly tâm đĩa. Thùng ly tâm chứa một dãy đĩa xung quanh một hình nón ở giữa. Khi dịch chiết đi vào, chất hạt bị bắn ra ngoài, chạm vào các đĩa hình nón và chất lắng tập trung trên thành của thùng. Phương pháp này cung cấp một đường chảy không đổi, vì thế hiệu suất ly tâm ít bị ảnh hưởng. Nhược điểm của kiểu ly tâm này là có hao hụt một lượng nhỏ sản phẩm trong suốt quá trình chảy ra ngoài của dịch chiết. Phương thức này cho phép đạt tới một lực ly tâm khoảng 8.000´g và có sức chứa lên đến 20 kg chất lắng.
- Ly tâm thúng. Được thiết kế để hoạt động ở các lực ly tâm thấp hơn nhiều, có thể chỉ 1.000 rpm, về cơ bản đó là các bộ lọc ly tâm. Thúng được đục thủng lỗ và thường được lót bằng vải lọc. Ứng dụng chính của ly tâm này là để thu thập các hạt nguyên liệu lớn; trong phạm vi tinh sạch enzyme đó thường là các nguyên liệu trao đổi ion được dùng cho hấp phụ theo mẻ protein mong muốn.

2.4. Lọc bằng màng
Lọc là một phương pháp khác để gạn các dịch chiết tế bào. Tuy nhiên, dịch nuôi cấy vi sinh vật và các dịch chiết có khuynh hướng trở thành dạng sệt tự nhiên thường gặp khó khăn khi lọc bằng các phương pháp truyền thống, trừ khi diện tích màng lọc được sử dụng là rất lớn.
Có thể khắc phục điều này bằng cách dùng phương pháp lọc dòng chảy ngang (cross-flow) hoặc tiếp tuyến (tangential). Trong phương pháp này dịch chiết chảy ở góc phải theo hướng lọc, và sử dụng tốc độ dòng chảy cao sẽ có khuynh hướng giảm sự tắc nghẽn bằng các hoạt động tự làm sạch. Chẳng hạn: để thu hồi ở quy mô lớn L-asparaginase từ Erwinia chrysanthemi người ta sử dụng một màng lọc có diện tích 1 m<SUP>2</SUP> dùng để thu hoạch tế bào từ 100 L của chất lỏng nuôi cấy trong 2,5 giờ lúc đó nồng độ các chất rắn ở phần được giữ lại trên màng tăng lên từ 0,55%-22% khối lượng khô. Sau đó, một màng giống như thế được dùng để gạn lọc dịch chiết thu được bằng phân giải kiềm các vi khuẩn này. Các số liệu này đã cho thấy rằng để thu hoạch tế bào từ 500 L nuôi cấy trong 2,5 giờ đòi hỏi màng phải có diện tích 7,5 m<SUP>2</SUP> và chi phí cho quá trình này ít hơn so với phương pháp ly tâm.
Do các hạn chế của ly tâm quy mô lớn nên kỹ thuật lọc màng thường được phối hợp sử dụng để đảm bảo rằng dịch chiết thật sự sạch cho bước sắc ký tiếp theo.

3. Hệ phân tách hai pha nước
Một phương pháp khác với ly tâm và lọc là phương pháp phân tách hai pha nước (aqueous two-phase separation), hay chất lỏng-chất lỏng. Các hệ hai pha nước đặc trưng được tạo ra bằng cách trộn các dung dịch polyethylene glycol (PEG) và dextran hoặc PEG và các loại muối như potassium phosphate hoặc ammonium sulphate để tạo thành hai pha riêng biệt. Các protein và mảnh vỡ tế bào có khả năng hòa tan khác nhau giữa hai pha, vì thế kỹ thuật này có thể được dùng cho cả hai trường hợp: phân tách protein khỏi mảnh vỡ tế bào và phân chia (partitioning) protein trong suốt quá trình tinh sạch. Sự phân chia chính xác của một protein tùy thuộc vào các thông số như khối lượng phân tử và điện tích của chúng, nồng độ và khối lượng phân tử của các polymer, nhiệt độ, pH và lực ion của hỗn hợp và sự hiện diện của các muối đa trị như phosphate hoặc sulphate. Các điều kiện tối ưu cho một protein đặc biệt thường được tìm thấy theo kinh nghiệm. Mặc dù, các điều kiện cần thiết để đạt được sự phân tách vừa ý có thể được xác định chính xác, nhưng cơ chế của sự phân chia hai pha hiện nay vẫn chưa được hiểu đầy đủ.
Các pha có thể được phân tách trong một thùng lắng, nhưng để phân tách nhanh và hiệu quả hơn có thể sử dụng phối hợp với phương pháp ly tâm. Vì phân tách các chất lỏng có mật độ khác nhau dễ dàng hơn phân tách các chất rắn ra khỏi các chất lỏng trên quy mô lớn, nên phương thức này có thể được dùng để hỗ trợ cho quá trình tinh sạch enzyme ở quy mô lớn. Mặc dù giá thành khá thấp của hệ thống PEG/muối đã khiến cho nó trở nên thích hợp hơn cho việc sử dụng ở quy mô lớn, nhưng hệ thống PEG/dextran (dextran có giá thành khá cao) phân tách hiệu quả hơn cũng là một phương pháp kinh tế nếu so sánh với các phương pháp tinh sạch khác. Sử dụng hệ phân tách hai pha nước không bị hạn chế đối với các nguyên liệu có nguồn gốc vi sinh vật, và phương pháp này được dùng thành công để phân lập các nguyên liệu khỏi cả hai nguồn thực vật và động vật, bao gồm cả a-L-antitrypsin của người được biểu hiện trong sữa chuyển gen. Trong trường hợp này độ tinh sạch sơ bộ của protein tương đối cao, tức là sau khi phân tách hai pha đơn thì protein mong muốn được tinh sạch tới 73%.
Sự phân tách hai pha nước bằng polyethylene glycol, dextran hoặc polyamines có thể tạo ra các pha phân chia chất lỏng trong đó các protein và enzyme mong muốn có thể được tập trung lại. Xử lý kiểu này cho phép thu hồi lại các polymers để sử dụng. Các phương pháp này được ứng dụng dễ dàng đối với toàn bộ dịch nuôi cấy có protein hoặc enzyme hòa tan (enzyme ngoại bào).
Sự phân tách hai pha nước có thể được cải tiến nhằm tạo sự phân chia đặc trưng sinh học bằng cách gắn các phối tử vào polymer để thay đổi sự phân chia của protein. Tất cả các polymer tạo pha có thể có các phối tử được gắn đồng hóa trị vào chúng, và một phạm vi nhiều phối tử như thế đã được khảo sát. Do liên kết hóa học đơn giản của chúng, các chất nhuộm phản ứng được sử dụng thường xuyên như các phối tử. Ngoài các thuốc nhuộm này, một số phối tử khác cũng đã được nghiên cứu. Những phối tử này bao gồm các cofactor, như pyridine nucleotide được sử dụng thành công trong phân chia ái lực các dehydrogenase.
Ở quy mô lớn, phương pháp ái lực đã được sử dụng cho tinh sạch formate dehydrogenase khỏi 10 kg nấm men Candida bodinii, bằng cách dùng thuốc nhuộm triazine, Procion Red HE-3B, được bất động trên PEG.
Mặc dù phân tách hai pha nước là phương pháp có thể phát triển dễ dàng ở quy mô lớn để sản xuất, nhưng dường như nó không được dùng thường xuyên để tinh sạch ở quy mô công nghiệp.
4. Các phương pháp kết tủa
Thông thường cần tiến hành giai đoạn kết tủa mẻ đầu tiên để làm giảm thể tích tổng số của dung dịch enzyme. Các enzyme có thể được kết tủa đơn giản, tuần tự hoặc phối hợp với ammonium sulphate, sodium sulphate, polyethyleneimine và polyallylamine, hoặc với các dung môi hữu cơ như là isopropanol, ethanol và acetone.
Streptomycin sulphate, polyethyleneimine và các polyamine khác có thể kết tủa các chất có tính chất acid như nucleic acid và các nucleoprotein. Ammonium sulphate và các dung môi hữu cơ có thể kết tủa một cách chọn lọc enzyme mong muốn với hoạt tính thu hồi từ 80-90%.
Kết tủa đơn giản cũng có thể giúp loại bỏ protease. Lợi ích chính của bước này là làm giảm thể tích hoạt động tổng số, thường bằng một thừa số của 20. Do đó sẽ giảm một cách ý nghĩa thể tích của nhựa trao đổi ion. Thay đổi pH và nhiệt độ cũng có thể tạo ra kết tủa chọn lọc và loại bỏ các protein không mong muốn.

4.1. Kết tủa bằng ammonium
Phương pháp xử lý muối các protein đã được sử dụng trong nhiều năm, và đạt được cả hai mục đích tinh sạch và cô đặc. Loại muối được sử dụng phổ biến nhất là ammonium sulphate, do khả năng hòa tan của nó, không có độc tính cho hầu hết các enzyme, và giá thành thấp.
Kết tủa protein bằng muối phụ thuộc vào nhiều nhân tố như: pH, nhiệt độ, nồng độ protein, và loại muối được sử dụng. Nồng độ protein là thông số đặc biệt quan trọng khi tăng quy mô, bởi vì hầu hết sự tinh sạch ở quy mô lớn được tiến hành ở các nồng độ protein cao hơn sự tinh sạch ở quy mô phòng thí nghiệm. Điều này có thể ảnh hưởng sâu sắc lên nồng độ của muối cần thiết để kết tủa protein mong muốn.

4.2. Kết tủa bằng các dung môi hữu cơ
Việc bổ sung các dung môi hữu cơ vào các dung dịch nước làm giảm khả năng hòa tan của protein do giảm hằng số điện môi của môi trường. Các dung môi hữu cơ khác nhau được dùng để kết tủa protein như ethanol, acetone, và 2-propanol là quan trọng nhất. Thường các protein bị biến tính bởi các dung môi hữu cơ nên cần thiết làm việc ở nhiệt độ dưới 0<SUP>o</SUP>C.
Do bản chất dễ cháy của các dung môi hữu cơ nên cần phải sử dụng thiết bị chịu lửa và giá thành cao, vì thế các dung môi hữu cơ thường không được dùng trong tinh sạch enzyme ở quy mô lớn. Ngoại trừ trường hợp xử lý máu (blood processing field), trong đó kết tủa ethanol là phương pháp chính để tinh sạch albumin; và trên thực tế phương pháp này đang được phát triển trong một hệ thống được điều khiển tự động bằng computer.

4.3. Kết tủa bằng các polymer khối lượng phân tử cao
Các chất kết tủa hữu cơ khác có thể được dùng để phân đoạn các protein là các polymer hòa tan trong nước như PEG. Chất này có ưu điểm là không có độc tính, không dễ cháy và không gây biến tính các protein. Nó được dùng chủ yếu trong lĩnh vực xử lý máu.

4.4. Kết tủa bằng nhiệt
Khi protein đủ bền khó bị biến tính, thì xử lý nhiệt có thể cung cấp một mức độ tinh sạch cao được xem như là bước đầu tiên. Ví dụ: Ở quy mô lớn, 55% protein không mong muốn được loại bỏ trong một bước riêng rẽ bằng cách làm nóng dịch chiết E. coli mang protein A của Staphylococcus tái tổ hợp ở 80<SUP>o</SUP>C trong 10 phút. Nếu protein tái tổ hợp được tinh sạch khỏi một cơ thể ưa nhiệt thì kết quả của xử lý nhiệt đầu tiên có thể là hiệu quả hơn nhiều. Ví dụ: Khi dịch chiết E. coli chứa malate dehydrogenase tái tổ hợp của Thermus aquaticus được làm nóng tới 80<SUP>o</SUP>C trong 20 phút, thì enzyme thuần nhất có trong thể nổi là khoảng 90%.

5. Các phương pháp sắc ký
Thuật ngữ sắc ký để chỉ các kỹ thuật phân tách và điều chế cho phép tách biệt các hợp phần khác nhau của một hỗn hợp. Phép phân tách sắc ký dựa vào sự di chuyển khác nhau trong một pha động của các chất hòa tan đã được gắn trên một pha tĩnh ở trạng thái rắn. Người ta thường chọn các chất có khả năng gắn kết được với các chất (hòa tan) định phân tách làm pha tĩnh. Tương tác giữa chất hòa tan và pha tĩnh có thể là tương tác hấp phụ, tương tác ion (trao đổi ion), tương tác kỵ nước, tương tác kiểu rây phân tử hoặc tương tác đặc hiệu sinh học.
Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký là một thực hành chuẩn ở phòng thí nghiệm trong nhiều năm. Để tinh sạch các sản phẩm có thể tích nhỏ và giá trị cao, các protein trị liệu hoặc chẩn đoán đặc hiệu, thì phương pháp sắc ký là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất. Sắc ký chỉ là phương pháp, với khả năng chọn lọc được yêu cầu, để tinh sạch một protein riêng rẽ khỏi hỗn hợp phức tạp của các protein tới một sự tinh sạch cuối cùng lớn hơn 95%.
Các kỹ thuật phân tách bằng sắc ký được sử dụng phổ biến, bao gồm trao đổi ion, tương tác kỵ nước, ngăn chặn kích thước, ái lực và ái lực giả (sắc ký với phối tử là thuốc nhuộm).
Bước làm sạch thêm có thể được thực hiện bằng cách dùng sắc ký ngăn chặn kích thước. Tuy nhiên, kỹ thuật này khó thực hiện ở quy mô lớn, và thường không cần thiết phải tinh sạch enzyme tới 99%. Nếu cần mức độ tinh sạch lớn hơn 95% có thể tiến hành sắc ký hấp phụ/khử hấp phụ thêm một lần nữa sẽ giúp thu được enzyme tinh sạch hơn. Các kỹ thuật tinh sạch như thế không làm tăng hoạt tính của enzyme, đây là một yếu tố phải được xem xét khi kết tủa enzyme có độ tinh khiết cao.
Các kết tủa enzyme tinh sạch cao thường được đông khô để bảo quản và vận chuyển. Các tác nhân bảo vệ lạnh đông polyhydroxy (cryoprotectants), các dung dịch đệm, các chất khử và các chất kháng khuẩn có thể được bổ sung nếu cần thiết.

5.1. Sắc ký lọc gel
Trong sắc ký lọc gel, sự phân tách protein được dựa trên cơ sở kích thước phân tử (Hình 6.9). Pha tĩnh chứa các hạt gel (polymer) xốp có những lỗ nhỏ li ti được bao quanh bởi pha dung môi chuyển động. Khi dung dịch chứa các protein chảy qua cột thì các phân tử lớn của hỗn hợp có đường kính lớn hơn lỗ của hạt gel nên không thể khuếch tán vào bên trong hạt (qua các lỗ nhỏ) và vì thế chúng đi qua các kẽ hở của cột và bị rửa khỏi cột trước cùng với thể tích dịch rửa bằng thể tích giữa các hạt gel V<SUB>o</SUB>. Các phân tử nhỏ hơn sẽ đi qua các lỗ nhỏ để khuếch tán vào trong các hạt gel và được rửa khỏi cột sau, thể tích dịch rửa của chúng bằng tổng thể tích (pha dung môi) của cột V<SUB>t</SUB>. Tổng thể tích của cột có thể biểu diễn như sau:

V<SUB>t</SUB> = V<SUB>o</SUB> + V<SUB>i</SUB> + V<SUB>m</SUB><SUB> </SUB>(2)​

Trong đó: V<SUB>t</SUB> là tổng thể tích của cột, V<SUB>o</SUB> là thể tích của dung môi ở bên ngoài các hạt, V<SUB>i</SUB> là thể tích của dung môi ở bên trong các hạt, và V<SUB>m</SUB> là thể tích bị chiếm bởi khuôn.
Thể tích rửa của protein vì vậy có thể thay đổi giữa V<SUB>o</SUB> và V<SUB>i</SUB>, và có thể tính toán hệ số phân chia hiệu quả (K<SUB>av</SUB>) có giá trị giữa 0 và 1:

<v:shape id=_x0000_i1039 style="WIDTH: 234pt; HEIGHT: 40.5pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=129a190fac1431bd.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image015.jpg"></v:imagedata></v:shape>​

Trong đó: V<SUB>e</SUB> là thể tích rửa của chất hòa tan.
Đối với các protein hình cầu, kinh nghiệm cho thấy giá trị của K<SUB>av</SUB> tỷ lệ nghịch với logarithm của khối lượng phân tử tương đối.

<v:shape id=_x0000_i1040 style="WIDTH: 245.25pt; HEIGHT: 308.25pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=2fc5535fa1e7f4ff.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image016.jpg"></v:imagedata></v:shape>​

Hình 6.9. Sơ đồ của sắc ký lọc gel
​

Cần lưu ý không có sự tương tác giữa khuôn và chất hòa tan, vì thế môi trường lọc gel lý tưởng phải trơ hoàn toàn. Để có sức chứa cực đại hạt gel phải rắn và có độ xốp cao. Trường hợp ở quy mô lớn, độ rắn có lẽ là thông số quan trọng nhất vì nó quyết định tốc độ dòng chảy cao nhất có thể đạt được.
Các nguyên liệu lọc gel truyền thống dựa trên cơ sở dextran liên kết chéo (Sephadex), hoặc polyacrylamide (BioGel P). Những nguyên liệu này là đủ trơ nhưng (ở các độ xốp thích hợp khác nhau để phân đoạn hầu hết các protein) lại quá mềm nên khó sử dụng trên quy mô lớn.
Các loại gel rắn hơn dựa trên cơ sở thay đổi những vật liệu khác nhau đã được đưa vào sử dụng, và thích hợp hơn cho ứng dụng trên quy mô lớn. Ví dụ: Sephacryl (Amersham Pharmacia Biotech) trên cơ sở dextran và polyacrylamide; Superdex (Amersham Pharmacia Biotech) trên cơ sở dextran và agarose, Superose (Amersahm Pharmacia Biotech) trên cơ sở agarose liên kết chéo cao. Tất cả những nguyên liệu này thích hợp cho các kích thước của hạt sao cho sự phân đoạn được duy trì ở các tốc độ dòng chảy cao nhờ độ rắn được tăng lên của hạt.

5.2. Sắc ký trao đổi ion
Sắc ký trao đổi ion được sử dụng rộng rãi nhất, có thể bao gồm cả trao đổi cation và anion mạnh và yếu. Các protein và enzyme nói chung được hấp phụ ở lực ion thấp hoặc ở các giá trị pH trong đó điện tích ion tổng số đủ mạnh để tương tác với điện tích đối của nhựa trao đổi ion. Sự tách rửa protein được thực hiện dễ dàng bằng cách thay đổi pH hoặc tăng lực ion của dung dịch rửa (Hình 6.10). Những nhựa trao đổi ion như thế có thể được dùng hoặc như một phương thức để hấp phụ tích cực và tách rửa chọn lọc enzyme mong muốn, hoặc nhờ vào sự hấp phụ đơn giản của các nguyên liệu protein không mong muốn.
Nhựa trao đổi ion là một khung vật liệu rắn không hòa tan có gắn với các nhóm ion hóa bằng liên kết đồng hóa trị. Các nhóm mang điện tích này lại được liên kết với các ion đối (opposite ions) và các ion đối lại có thể trao đổi thuận nghịch với các ion trái dấu. Một khung có mang các nhóm tích điện dương và ion đối tích điện âm, được gọi là nhựa trao đổi anion (anion exchange resin). Ngược lại, một nhựa trao đổi cation sẽ mang điện tích âm.
Ngoài ra, các nhựa trao đổi thường khác nhau về bản chất hóa học của giá khung (polysaccharide gel hay nhựa tổng hợp) cũng như về lực acid, base của nhóm ion hóa. Ba loại nhựa trao đổi ion được trình bày trong bảng 6.1.

<v:shape id=_x0000_i1041 style="WIDTH: 372.75pt; HEIGHT: 312.75pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=c5c8a46380df11b2.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image017.jpg"></v:imagedata></v:shape>​

Hình 6.10. Sơ đồ sắc ký trao đổi ion
​

Các protein của một hỗn hợp cần phân tích thường có các nhóm bên ion hóa khác nhau, do đó có pH khác nhau. Ở một giá trị pH nhất định các protein sẽ có một điện tích không giống nhau, do đó chúng được giữ nhiều hay ít bằng tương tác ion trên một nhựa trao đổi ion đã cho và với một pha di động đã cho.
Trong thực tế người ta thường dùng các dung dịch đệm phosphate, acetate, borate và citrate để chiết protein ra khỏi cột. Các protein khác nhau sẽ được chiết ra khỏi cột theo từng phân đoạn chiết khác nhau, trong đó phân đoạn protein cần thu có nồng độ cao nhất.

Bảng 6.1. Bản chất hóa học của các loại nhựa trao đổi ion​

<v:shape id=_x0000_i1042 style="WIDTH: 372.75pt; HEIGHT: 221.25pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=74eeb76e582d5cea.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image018.jpg"></v:imagedata></v:shape>​

Một số nhựa trao đổi ion từ các dẫn xuất của cellulose đang được sử dụng như sau:

<v:shape id=_x0000_i1043 style="WIDTH: 372pt; HEIGHT: 128.25pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=1fc95983875cc504.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image019.jpg"></v:imagedata></v:shape>​

Quá trình phân tách trên cột bao gồm hai giai đoạn:
- Hấp phụ thuận nghịch protein cần tinh sạch (và các protein có điện tích gần giống) vào nhựa trao đổi ion.
- Khử hấp phụ các protein bằng cách: (1) thay đổi pH của dịch rửa sẽ dẫn đến thay đổi độ ion hóa và do đó thay đổi điện tích tổng của protein, hoặc (2) tăng lực ion và tăng nồng độ ion đối cạnh tranh. Các protein nào có ái lực với nhựa trao đổi ion yếu nhất sẽ bị đẩy ra trước tiên và ngược lại. Khi sử dụng gradient lực ion hoặc/và gradient pH thường làm tăng chất lượng của phép phân tách protein.
Với các enzyme có tính acid, người ta thường sử dụng các anionic cellulose để tách và tinh sạch. Các nhựa đi từ các dẫn xuất của cellulose có kích thước lỗ lớn, sử dụng rất thích hợp để tách, tinh sạch enzyme ở quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, do hệ số nén cao nên đã phần nào gây khó khăn khi tiến hành sắc ký. Để khắc phục nhược điểm trên, người ta sử dụng các dẫn xuất của agarose liên kết chéo như: Sepharose CL-6B hoặc polymer tổng hợp: trisacryl có hiệu suất cao, hệ số nén không đáng kể, không thay đổi thể tích theo pH và cường độ ion, có thể tái tạo lại nhựa mà không cần tách khỏi cột.
Trong sắc ký trao đổi ion, việc gắn một protein vào nhựa trao đổi ion sẽ phụ thuộc vào trạng thái ion hóa của nó, cũng như trạng thái ion hóa của nhựa trao đổi, pH, lực ion và nhiệt độ. Đối với những protein không bị biến tính ở pH cao hơn điểm đẳng điện của chúng thì có thể dùng DEAE-cellulose (nhựa trao đổi anion) còn đối với các protein không bị biến tính ở pH thấp hơn điểm đẳng điện của chúng thì có thể sử dụng ở CM-cellulose (nhựa trao đổi cation).

5.3. Sắc ký ái lực (affinity chromatography)
Phương pháp này dựa vào khả năng liên kết đặc hiệu và thuận nghịch của một protein với một phân tử khác (phối tử), đã được gắn bằng liên kết đồng hóa trị vào một chất mang không hòa tan chứa trong cột sắc ký. Khi cho một hỗn hợp có chứa protein cần làm sạch đi qua thì chỉ có protein quan tâm bị giữ lại, còn tất cả các protein khác không tương tác được với phối tử (ligand) sẽ bị rửa trôi ra khỏi cột (Hình 6.11). Tiếp đó, protein sẽ bị rửa giải ra bằng các phương pháp khác nhau.
Phương pháp sắc ký ái lực rất hiệu quả trong việc tinh sạch các enzyme, cho phép thu được enzyme có độ sạch cao (hơn sắc ký trao đổi ion khoảng 10 lần) chỉ bằng một giai đoạn và trong một thời gian ngắn.
Các nhân tố như chất mang, phối tử, phương pháp gắn kết phối tử cũng như các điều kiện rửa giải enzyme đều có vai trò quan trọng trong sắc ký ái lực.

<v:shape id=_x0000_i1044 style="WIDTH: 256.5pt; HEIGHT: 425.25pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=e3930b99fb11e4af.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image020.jpg"></v:imagedata></v:shape>​

Hình 6.11. Sơ đồ sắc ký ái lực
​

5.3.1. Chất mang (pha tĩnh)
Phải có một số tính chất sau:
- Hoàn toàn không hòa tan trong pha di động.
- Có độ bền về hóa học và sinh học.
- Có độ cứng cơ học, có tính háo nước và tính thấm.
- Không có các tương tác phi đặc hiệu.
- Có chứa nhiều nhóm chức có khả năng biến đổi khi hoạt hóa trong các điều kiện nhẹ nhàng.
Các chất mang thường là dẫn xuất của cellulose, các dextran gel, thủy tinh xốp... Tuy nhiên, người ta hay dùng agarose hoặc các gel hỗn hợp agarose và polyacrylamide vì chúng có thêm khả năng lọc gel.

5.3.2. Phối tử
Phối tử thường là những chất tương tự cơ chất của enzyme muốn tinh sạch, chất kìm hãm hoặc cofactor. Phối tử nói chung phải đặc hiệu với protein và phải có một ái lực trung bình với nó. Nồng độ phối tử cũng phải được chọn thích hợp và nếu thừa phối tử sẽ gây ra những án ngữ không gian đáng kể. Trường hợp khi phối tử là một phân tử nhỏ hoặc khi phân tử enzyme quá lớn có thể gây ra sự “cồng kềnh không gian” thì phối tử sẽ được nối dài thêm bằng một đoạn “cánh tay đòn” để nó dễ tiếp cận với tâm hoạt động của enzyme. Cánh tay đòn thường là một mạch carbohydrate nhị chức dài từ 6-8 carbon.

5.3.3. Hoạt hóa chất mang
Phối tử (và cánh tay đòn) phải được gắn lên chất mang. Chất mang trước tiên phải được hoạt hóa với cyanogen bromide (CNBr). CNBr sẽ phản ứng với các nhóm hydroxyl của agarose, chẳng hạn để tạo ra một imidocarbamate và imidocarbamate dễ dàng tác dụng với một amine bậc nhất của cánh tay đòn.

5.3.4. Rửa giải
Sau khi loại bỏ các protein khác, enzyme cần tinh sạch có thể được rửa giải ra khỏi cột sắc ký nhờ phức hợp của nó với phối tử có bản chất phi đồng hóa trị và thuận nghịch. Dung dịch rửa giải thường phải có: (1) hoặc có chứa một phối tử tự do của enzyme có khả năng cạnh tranh với phối tử đang ở trạng thái liên kết với enzyme, (2) hoặc do pH của mình có thể gây biến tính thuận nghịch enzyme do đó làm biến dạng tâm hoạt động của enzyme. Có thể làm yếu tương tác đặc hiệu sinh học bằng cách thay đổi lực ion. Phối tử cạnh tranh (hoặc dung dịch đệm làm biến tính) sau đó được loại bỏ bằng phương pháp thẩm tích.
5.4. Sắc ký tương tác kỵ nước
Sắc ký tương tác kỵ nước sử dụng tính chất kỵ nước của protein bề mặt như là một đặc điểm để chọn lọc. Loại phân tách này thích hợp khi được tiến hành tiếp theo bước kết tủa ammonium sulphate, và không cần thiết phải loại bỏ muối trước khi thực hiện bước sắc ký này. Bằng cách dùng các kỹ thuật hấp phụ và khử hấp phụ bề mặt sẽ làm giảm mạnh thể tích của các dung dịch protein và lượng protein cần tinh sạch sẽ tăng lên từ 90-95%. Chất lượng này đủ cho hầu hết các ứng dụng của protein đặc biệt.
Các protein sẽ lần lượt được phân tách ra tùy theo tương tác của chúng với một chất mang có chứa các nhóm kỵ nước (ưa béo). Các protein chứa các nhóm kỵ nước trên bề mặt, chất mang kỵ nước và dung môi ưa nước tạo thành một hệ ba thành phần và tương tác được với nhau. Hệ này có thể bị rối loạn khi thay đổi nhiệt độ, pH hoặc lực ion.
Nói chung, các tương tác sẽ mạnh nếu ta tăng lực ion (ví dụ: dung dịch NaCl 4 M). Các protein bị giữ lại, tiếp đó có thể được rửa giải một cách chọn lọc bằng cách giảm lực ion này hoặc bằng cách giảm độ phân cực của dung môi rửa (thêm ethylene glycol hoặc một chất tẩy rửa hoặc tăng pH dịch rửa). Có thể gắn các nhóm khác nhau lên chất mang. Ví dụ ở octylsepharose (R) CL-4B và phenylsepharose CL-4b, các nhóm octyl và phenyl đã được đính lên các đơn vị monosaccharide của agarose bằng liên kết ester không tích điện và bền hóa học. Ở những chất mang khác thì có thể sử dụng những nhóm kỵ nước khác.

5.5. Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu suất cao (high performance liquid chromatographic techniques)-HPLC
Còn được gọi là sắc ký lỏng cao áp (high pressure) hay sắc ký lỏng giá thành cao (high price). Đây là phương pháp phân tách các chất bằng cách dùng áp suất để đẩy nhanh dung dịch qua cột sắc ký với một hiệu suất cao. Đầu tiên, kỹ thuật này được thiết kế để phân tách các phân tử hữu cơ nhỏ hòa tan trong các dung môi không phải nước, sau đó kỹ thuật này đã nhanh chóng phát triển thành một phương thức thích hợp để phân tách các protein trong các dung môi nước. Tuy nhiên, đa số các ứng dụng đã được công bố với kỹ thuật sắc ký này đều chỉ giới hạn ở quy mô phòng thí nghiệm.
HPLC sử dụng một loại cột chứa các hạt nhỏ rất đồng nhất, có tác dụng cải thiện sự ổn định vật lý và hóa học và phân tách nhanh hơn các gel mềm truyền thống. Cột sắc ký chứa các vật liệu đệm kín có độ phân giải cao (8, 15 hoặc 40 µm) cho phép sản xuất các phân đoạn cô đặc hơn. Các hạt nhỏ có sức bền cao đối với dòng chảy của chất lỏng để thiết bị được thiết kế hoạt động ở áp suất tương đối cao. Dung môi được phân phối vào cột bằng bơm với dòng không có xung, không thay đổi ở áp suất ngược cao. Cột có khả năng chịu đựng sự tăng áp suất. Đầu dò (detector) có thời gian phản ứng nhanh vì các đỉnh protein có thể trải qua trong một vài giây. Ưu điểm chính của hệ thống HPLC là có thời gian chạy nhanh hơn nhiều so với các phương pháp sắc ký khác nhưng nhược điểm của hệ thống này là đắt tiền nên khó áp dụng ở quy mô lớn.



6. Siêu lọc
Siêu lọc đã trở thành một kỹ thuật tiêu chuẩn của phòng thí nghiệm để cô đặc các dung dịch protein dưới các điều kiện rất ôn hòa. Phương pháp này được sử dụng trong trường hợp thẩm tách hoặc lọc gel để khử muối hoặc trao đổi đệm. Bằng cách dùng các chất kết tủa ái lực để tăng khối lượng phân tử của protein mong muốn, phương pháp này cũng có thể được dùng như một kỹ thuật tinh sạch.
Hệ siêu lọc thường sử dụng màng lọc có bề mặt nhẵn hoặc màng lọc hệ sợi rỗng. Các sợi này có đặc điểm tương tự với các bề mặt nhẵn, nhưng đối với các quá trình ở quy mô lớn thì nó tạo ra một diện tích bề mặt lớn hơn thể tích đã cho. Ở trường hợp hoạt động ở quy mô pilot, hệ siêu lọc thích hợp với diện tích màng lên tới 6,4 m<SUP>2</SUP>, cho tốc độ siêu lọc lên tới 200 L/giờ, tùy thuộc vào nồng độ của protein. Các hệ lớn hơn thích hợp với các tốc độ siêu lọc của hàng trăm lít/giờ. Sử dụng phương pháp này có thể ứng dụng cho hầu hết mọi quy mô hoạt động.

7. Thiết kế các protein để tinh sạch
Các nhân tố ở quá trình chuẩn bị cơ chất và nguyên liệu sản xuất (upstream processing) có thể ảnh hưởng đến sự phát triển phương thức tinh sạch protein sau này, công nghệ DNA tái tổ hợp cũng có một ảnh hưởng quan trọng lên sự tinh sạch protein. Bằng cách dung hợp một gen quan tâm với một trình tự promoter hiệu quả, thì một protein ngoại lai có thể được biểu hiện trong cơ thể vật chủ từ 10 tới 40% protein tổng số hòa tan của tế bào. Điều này có thể so sánh với sự biểu hiện của nhiều protein nguyên thể (chỉ chiếm khoảng 0,01 tới 4% protein tổng số hòa tan của tế bào). Vì vậy, quá trình tinh sạch tiếp theo của protein được đơn giản hóa. Đối với các protein được biểu hiện trong một dạng hòa tan, các kỹ thuật di truyền có thể được dùng để hướng tới việc protein được tổng hợp mới trong gian bào, hoặc thậm chí trong môi trường nuôi cấy. Điều này có thể làm tăng sự ổn định của protein được biểu hiện (vì chỉ hai trong số tám protease được biết của E. coli là hoàn toàn ở trong gian bào) và đơn giản hóa sự tinh sạch (vì chỉ khoảng 8% của tất cả protein của E. coli là ở khoang gian bào).

7.1. Các thể vùi (inclusion)
Các mức độ biểu hiện cao như thế đã sản xuất được rất nhiều protein, dẫn đến xuất hiện các hạt không hòa tan được gọi là các thể vùi. Trường hợp này đã được quan sát ở nhiều protein tái tổ hợp, bao gồm urogastrone, interleukin-2, prochymosin và các interferon. Sau khi phá vỡ tế bào, các hạt như thế có thể được lắng xuống đáy với một lực ly tâm (RCF) tương đối thấp, sản xuất nguyên liệu không hòa tan chứa hơn 50% protein mong muốn.
Nguyên nhân tạo thành các thể vùi chưa được biết đầy đủ, vì không phải tất cả protein biểu hiện ở mức độ cao đều tạo thành thể vùi. Tế bào vật chủ cũng thể hiện một vai trò quan trọng. Cấu trúc chính xác của protein tái tổ hợp cũng có thể ảnh hưởng sự tạo thành các thể vùi. Một nghiên cứu được thực hiện bằng cách dùng g-interferon người tái tổ hợp cho thấy rằng chỉ một vài thay đổi amino acid cũng có thể ảnh hưởng đến sự chuyển hóa giữa các biểu hiện của protein hòa tan và không hòa tan trong E. coli.
Thông thường, các thể vùi được hòa tan trong urea hoặc guanidinium chloride (thường ở giá trị pH cao) và một vài trường hợp có thể bổ sung chất tẩy rửa. Một khi được hòa tan, protein phải được tái cuộn xoắn thành một cấu hình tự nhiên. Trong nhiều trường hợp, chỉ cần pha loãng đơn giản của dịch chiết hòa tan trong một đệm thích hợp là đủ. Nếu protein chứa các cầu nối disulfide, người ta cần phải tiến hành oxy hóa và khử glutathione để cung cấp một môi trường thích hợp giúp cho chúng được tạo thành chính xác. Thỉnh thoảng cần bổ sung đồng dung môi (co-solvent), như PEG, hoặc các chất tẩy rửa như Triton X-100, Tween 20 hoặc Zwittergent 3-16. Trong một số trường hợp, các protein hòa tan có thể rất khó tái cuộn xoắn, và người ta thấy rằng việc bổ sung chaperonins có thể giúp ích cho các quá trình tái cuộn xoắn. Chaperonins là các protein cần để đảm bảo cuộn xoắn chính xác các in vivo protein, với khả năng thuận lợi của chaperonin tái tổ hợp chúng được dùng để xúc tác cho quá trình tái cuộn xoắn chính xác của các protein in vitro.

7.2. Các đuôi ái lực
Khái niệm đuôi ái lực xuất hiện khi thiết kế di truyền với mục đích giúp cho sự tinh sạch protein hoặc enzyme hiệu quả hơn. Gen của protein quan tâm được dung hợp với chuỗi DNA mã hóa cho một số trình tự amino acid sẽ đơn giản hóa quá trình tinh sạch protein, bằng cách biến đổi các tính chất của nó trong một kiểu có thể dự đoán. Một trong các trường hợp đầu tiên là dung hợp di truyền của một số gốc arginine với C-terminus của urogastrone. Gen này sẽ sản xuất một protein liên kết mạnh với khuôn trao đổi ion cho cation. Đuôi polyarginine sau đó được loại bỏ bằng cách dùng enzyme bất động carboxypeptidase A.
Bảng 6.2. Các phương pháp loại bỏ các đuôi ái lực

<v:shape id=_x0000_i1045 style="WIDTH: 366.75pt; HEIGHT: 418.5pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=d03f35aacde7d985.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image021.jpg"></v:imagedata></v:shape>​

Khó khăn chủ yếu ở các dung hợp ái lực để tinh sạch protein là phải loại bỏ thành công đuôi ái lực và các tác nhân được sử dụng. Vấn đề này có thể được giải quyết từng phần bằng sự biến nạp di truyền các điểm đặc hiệu cao cho protease hoặc cho sự cắt bỏ các liên kết acid không bền ở chỗ nối của protein tái tổ hợp và đuôi ái lực. Nhiều phương pháp phân cắt đã được gợi ý (Bảng 6.2). Sử dụng các protease đặc hiệu là thích hợp hơn cả, bởi vì có thể ứng dụng trong các điều kiện “nhẹ nhàng”, chủ yếu là thrombin, enterokinase và Factor X<SUB>a</SUB>. Tất cả những protein này hoạt động ở 37<SUP>o</SUP>C và có thể phân cắt ở các vị trí bên trong protein quan tâm, hoặc do mất tính đặc hiệu hoặc từ sự nhiễm bẩn các protease. Cuối cùng, các bước sắc ký tiếp theo sẽ được yêu cầu để loại bỏ đuôi ái lực được phân cắt và protease.

Bảng 6.3. Các phương pháp tinh sạch protein bằng đuôi ái lực​

<v:shape id=_x0000_i1046 style="WIDTH: 371.25pt; HEIGHT: 355.5pt" alt="Trình duyệt của bạn có thể không hỗ trợ hiển thị hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata o:href="http://mail.google.com/mail/?name=5bd7d2be7159a242.jpg&attid=0.3&disp=vahi&view=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_image022.jpg"></v:imagedata></v:shape>​

Trong sự phát triển gần đây của lĩnh vực này, người ta đã sử dụng dạng tái tổ hợp của protease 3C từ rhinovirus của người. Protease này có kích thước nhỏ (20 kDa) và có một tính đặc hiệu rất hạn chế (Bảng 6.3). Nó được biểu hiện như là một protein tái tổ hợp được dung hợp với glutathione-S-transferase. Điều này có một vài ưu điểm, bản thân protease có thể được tinh sạch bằng sắc ký ái lực trên glutathione-Sepharose. Nếu protein đích được biểu hiện như là một sự dung hợp với glutathione-S-transferase thì nó có thể được tinh sạch trên cột glutathione-Sepharose. Sau khi xử lý với protease, protein đích có thể được phân tách khỏi đuôi glutathione-S-transferase và protease bằng cách chuyển qua cột glutathione-Sepharose thứ hai.
Một cách khác, phản ứng phân cắt có thể được đặt trên cột glutathione-Sepharose thứ nhất bằng cách bổ sung protease vào đệm của cột, vì thế tránh được sự cần thiết cho một cột thứ hai. Protease này có sẵn ở dạng thương mại dưới tên PreCission protease do Amersham Pharmacia Biotech sản xuất (Bảng 6.2).

Tài liệu tham khảo/đọc thêm
1. Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy và Nguyễn Xuân Sâm. 2004. Công nghệ enzyme. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
2. Nguyễn Văn Uyển và Nguyễn Tiến Thắng. 1999. Những kiến thức cơ bản về công nghệ sinh học. NXB Giáo dục, Hà Nội.
3. Bains W. 2003. Biotechnology from A to Z. Oxford University Press Inc. New York, USA.
4. Glick BR and Pasternak JJ. 2003. Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. 3<SUP>rd</SUP> ed. ASM Press, USA.
5. Lee JM. 2000. Biochemical Engineering. Prentice Hall Inc. USA.
6. Ratledge C and Kristiansen B. 2002. Basic Biotechnology. Cambridge University Press, UK.
7. Shuler ML and Kargi F. 2002. Bioprocess Engineering-Basic Concepts. 2<SUP>nd</SUP> ed. Prentice Hall Inc. New Jersey, USA.
8. Walker JM. 2002. The Protein Protocol Handbook. 2<SUP>nd</SUP> ed. Humana Press Inc. NewJersey, USA.
9. Walker JM and Rapley R. 2002. Molecular Biology and Biotechnology. 4<SUP>th</SUP> ed. The Royal Society of Chemistry,
<o> </o>

 

[Lê Đoàn Thanh Lâm]

Cho hỏi bài review này ai viết thế ?

 

[thangnho_12]

anh có thể giải thích rõ phần sắc kí theo tương tác kị nước được không ạ?????

 

[jony_nguyen]

tác giả có tâm huyết tìm đọc sách và dịch cho độc giả, nhưng hình như tác giả là người chưa trực tiệp làm về sắc kí và tinh sạch protein.

 

[Phoebe]

Bài viết hay quá. Khá rõ và chi tiết. Cảm ơn tác giả

 

[khanhlong123]

cái này áp dụng phân tách tế bào được nè

 

[Đinh Thùy Dương]

có cách nào có thể xem hoàn chỉnh bài viết không ạ???