Các phương pháp phân tích PCR

[viet23ht]

Hỏi địa chỉ của Cường

He he, chú Cường cứ cho anh địa chỉ, khi nào có thì anh bán cái cho, lấy 5% uống bia cỏ thôi.
Những mẫu mình làm hơi khó nhằn, multi C thường ngáng chân nên chạy giải trình tự rất mệt. Thế nhưng khó nhất là khâu tách chiết... Có gì Cường cứ liên hệ qua mail nhé.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

He he, chú Cường cứ cho anh địa chỉ, khi nào có thì anh bán cái cho, lấy 5% uống bia cỏ thôi.
Những mẫu mình làm hơi khó nhằn, multi C thường ngáng chân nên chạy giải trình tự rất mệt. Thế nhưng khó nhất là khâu tách chiết... Có gì Cường cứ liên hệ qua mail nhé.

Bác đã có cách xử lý polyC hay tandem repeat chưa? Khâu tách chiết thì không phải vấn đề gì khó khăn cả, giờ thì hầu như cứ trong mẫu có DNA là người ta tách được cả. Kit cũng nhiều, protocol cũng vô khối. Quan trọng là chọn phương pháp nào cho giá thành phù hợp thôi.

 

[viet23ht]

Tách chiết ADN

Thực ra mình chưa có cách xử lý multi C, nên với những mẫu này thì thường là móm 50%. Nếu bạn biết thì vui lòng chỉ giáo.
Còn những đoạn lặp lại thì mình dùng phương pháp phân tích đoạn chứ không dùng phân tích từng nu. Cái này thì đa số là OK, chỉ vướng những mẫu ADN đã bị biến tính hay bị phân huỷ.
Mẫu của mình bị biến tính thì cũng có KIT mới, nhưng mà đôi khi lại thiếu 1 số dụng cụ hỗ trợ, đang khắc phục.
Có những mẫu ADN cổ đại, lâu quá rồi, có hãng quảng cáo 50 năm vẫn tách được, chạy được, thế mà tớ hì hục mãi...
Kết quả chưa mấy sáng sủa.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Thực ra mình chưa có cách xử lý multi C, nên với những mẫu này thì thường là móm 50%. Nếu bạn biết thì vui lòng chỉ giáo.
Còn những đoạn lặp lại thì mình dùng phương pháp phân tích đoạn chứ không dùng phân tích từng nu. Cái này thì đa số là OK, chỉ vướng những mẫu ADN đã bị biến tính hay bị phân huỷ.

Không dám dùng từ chỉ giáo. Khoa học là chia xẻ mà.

Một trong những cách đơn giản và dễ thấy hiệu quả nhất là dùng tăng lượng Taq trong phản ứng đọc trình tự. Tăng bao nhiêu thì tùy vào thiết bị hóa chất bác dùng và cần làm thí nghiệm so sánh rồi xác định nồng độ tối ưu.

Với những mẫu DNA genome bị phân hủy thì có thể dùng DNA ty thể.

 

[viet23ht]

Multi C

Cảm ơn Hưng nhé, nhưng mà mình vướng chủ yếu ở khâu tách chiết Mt DNA và các mẫu đã bị phân huỷ. Còn multi C ở trình tự của ADN ti thể thì mình sẽ học kinh nghiệm của Hưng vậy.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Cảm ơn Hưng nhé, nhưng mà mình vướng chủ yếu ở khâu tách chiết Mt DNA và các mẫu đã bị phân huỷ. Còn multi C ở trình tự của ADN ti thể thì mình sẽ học kinh nghiệm của Hưng vậy.

Trước em có làm ở phòng CNTBDV, nơi chú Lê Quang Huấn rất thành công trong tách chiết DNA ty thể từ các mẫu hài cốt liệt sỹ (thường được chôn cất không có áo quan, ở các điều kiện dễ phân hủy và qua hàng chục năm), nhưng đều đã làm rất thành công. Bác qua đó trao đổi chắc sẽ xử lý được vấn đề.

Về sequencing các template "không bình thường" nhân tiện em tổng kết 1 số cái em học lóm được tại đây, hy vọng giúp được bác

1. Trình tự giàu G/C
- Bổ sung DMSO (2%-5%) vào sequencing reaction.
- Bổ sung betain (5%) vào sequencing reaction.
- Tăng melting temperature trong phản ứng PCR đọc trình tự
- Bổ sung thêm Taq, dNTP hoặc dùng dGTP Big Dye kit (ở đó họ thay dGTP bằng dITP) trong phản ứng PCR đọc trình tự.

2. Trình tự chứa cấu trúc bậc hai --> đọc được 1 đoạn ngắn thì bị ngắt đột ngột, cái này nhìn pic từ kết quả đọc trình tự biết ngay
- Xử lý bằng các cách áp dụng cho trường hợp 1

3. Trình tự chứa homopolymer region (ví dụ poly C, poly T...)
- Tăng nồng độ Taq trong phản ứng đọc trình tự
- Thiết kế primer gắn bổ sung với vùng homopolymer (tuy nhiên nhược điểm là không xác định được độ dài của của homopolymer trong trình tự cần đọc)

Có một cách khác rất hiệu quả để xử lý các trình tự khó là transcriptional sequencing nhưng không dễ áp dụng. Nếu bác quan tâm thì search pubmed sẽ thấy.

Good luck.

 

[viet23ht]

Cảm ơn Hưng nhé

Mình "nắm cháo" sang học tiến sĩ Huấn cách đây khoảng 2 năm rồi, phương pháp đó khá ấn tượng nhưng thực sự thì mình chưa có đủ phương tiện, thời gian mần kỹ món này.
Kit bigdye của mình dùng thì không được biết thành phần nhưng mình có mấy món hoá chất rời, cố gắng bổ sung dò tìm vậy.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Mình "nắm cháo" sang học tiến sĩ Huấn cách đây khoảng 2 năm rồi, phương pháp đó khá ấn tượng nhưng thực sự thì mình chưa có đủ phương tiện, thời gian mần kỹ món này.
Kit bigdye của mình dùng thì không được biết thành phần nhưng mình có mấy món hoá chất rời, cố gắng bổ sung dò tìm vậy.

Hehe, thế có khi anh em mình đã từng nhìn thấy nhau vì đợt đó em vẫn ở đấy . Nếu bác ở trong đoàn có người mất di động rồi tìm lại được thì có lẽ đã từng ngồi cùng bàn nhậu ở quán gì đó quên tên trong buổi cuối cùng.

Nhưng hồi đó em chỉ tập trung ăn thôi chứ không nói chuyện gì với mọi người.

Vậy là quen nhau rồi nhé, sau này em cần đọc trình tự bác cho em free vài mẫu nhé .

 

[Trịnh Thành Trung]

He he, chú Cường cứ cho anh địa chỉ, khi nào có thì anh bán cái cho, lấy 5% uống bia cỏ thôi.
Những mẫu mình làm hơi khó nhằn, multi C thường ngáng chân nên chạy giải trình tự rất mệt. Thế nhưng khó nhất là khâu tách chiết... Có gì Cường cứ liên hệ qua mail nhé.

@ Đc Cường: chơi đi đồng chí Cường ơi, phát này giàu to rồi. Đồng chí cứ lấy đúng giá 522,5 usd / 1 trình tự 400 nu nhé. (Không thiếu một trinh, đã trừ 5% hoa hồng rùi). Tính ra tiền Việt vẫn là trên 8 triệu. Qui ra thóc là cũng được hơn tấn đấy. :d

@ Bác Lương: Bác cũng chuẩn bị sắm máy real-time PCR đi nhé. Em thấy cái vấn đề này cũng được đấy, lãi hơn cả buôn heroin. Chẳng mấy chốc gỡ lại được vốn ngay, mà lại có của ăn của để nữa chứ. Hic hic...

@ Bác Hiếu: Bác liên hệ với mấy công ty bán phần mềm xử lý số liệu sinh học nhé (hay còn gọi là tin-sinh). Đánh mặt hàng này về Việt Nam tại thời điểm này có vẻ thích hợp đấy. Một số nơi người ta sẵn sàng mua với giá cao ngất trời.

Khi nào có 'quả sung' nào rụng xuống thì các bác báo cho anh em biết nhé (để anh em chia vui cùng các bác), kẻo cứ nằm chờ mãi, chờ mãi mãi mãi...

 

[viet23ht]

Thế thì biết nhau thật rùi, mình rất ấn tượng với phong cách của Tiến sĩ Huấn. Không biết bây giờ Tuấn còn làm ở đấy không? Mà Hưng bao giờ học xong?
Bọn mình đa số bận nên lâu rồi không sang Viện, có vụ nào toàn kính chuyển sang Tiến sĩ Huấn thôi.
Có mẫu nào cần đọc thì cứ gửi, "giảm giá" tối đa.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Thế thì biết nhau thật rùi, mình rất ấn tượng với phong cách của Tiến sĩ Huấn. Không biết bây giờ Tuấn còn làm ở đấy không? Mà Hưng bao giờ học xong?
Bọn mình đa số bận nên lâu rồi không sang Viện, có vụ nào toàn kính chuyển sang Tiến sĩ Huấn thôi.
Có mẫu nào cần đọc thì cứ gửi, "giảm giá" tối đa.

Hihi em còn đến 2010 cơ. Bác Tuấn vẫn ở đấy, mới lấy vợ 3 hôm trước xong hihi. Cảm ơn bác đã "giảm giá" tối đa .

@Ku Cường có làm ăn với bác viet23ht thì cẩn thận nhé. Xem hợp đồng cẩn thận vào, không có hóc đấy .

 

[Vũ Hải Chi]

Trước em có làm ở phòng CNTBDV, nơi chú Lê Quang Huấn rất thành công trong tách chiết DNA ty thể từ các mẫu hài cốt liệt sỹ (thường được chôn cất không có áo quan, ở các điều kiện dễ phân hủy và qua hàng chục năm), nhưng đều đã làm rất thành công. Bác qua đó trao đổi chắc sẽ xử lý được vấn đề.

Về sequencing các template "không bình thường" nhân tiện em tổng kết 1 số cái em học lóm được tại đây, hy vọng giúp được bác

1. Trình tự giàu G/C
- Bổ sung DMSO (2%-5%) vào sequencing reaction.
- Bổ sung betain (5%) vào sequencing reaction.
- Tăng melting temperature trong phản ứng PCR đọc trình tự
- Bổ sung thêm Taq, dNTP hoặc dùng dGTP Big Dye kit (ở đó họ thay dGTP bằng dITP) trong phản ứng PCR đọc trình tự.

2. Trình tự chứa cấu trúc bậc hai --> đọc được 1 đoạn ngắn thì bị ngắt đột ngột, cái này nhìn pic từ kết quả đọc trình tự biết ngay
- Xử lý bằng các cách áp dụng cho trường hợp 1

3. Trình tự chứa homopolymer region (ví dụ poly C, poly T...)
- Tăng nồng độ Taq trong phản ứng đọc trình tự
- Thiết kế primer gắn bổ sung với vùng homopolymer (tuy nhiên nhược điểm là không xác định được độ dài của của homopolymer trong trình tự cần đọc)

Có một cách khác rất hiệu quả để xử lý các trình tự khó là transcriptional sequencing nhưng không dễ áp dụng. Nếu bác quan tâm thì search pubmed sẽ thấy.

Good luck.

Các chiêu của bác Hưng phức tạp quá, em có cách đơn giản lắm, keke, mẫu nào không làm được, vứt em làm cho

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Các chiêu của bác Hưng phức tạp quá, em có cách đơn giản lắm, keke, mẫu nào không làm được, vứt em làm cho

1. Không thấy phức tạp chỗ nào.

2. Chú giữ nghề như vậy đôi khi cũng không phải tốt đâu.

 

[Vũ Hải Chi]

1. Nhiều hơn cách làm bình thường một đống thứ thì gọi là phức tạp.
2. Thầy em kể: ngày xưa lab thầy, hàng năm, cứ phải mời một chú người Hàn sang để biểu hiện protein XXX. Chủng có, thiết bị hóa chất đủ, người thì thừa, nhửng chỉ có chú Hàn biểu hiện được, thế mới lạ.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

1. Nhiều hơn cách làm bình thường một đống thứ thì gọi là phức tạp.
2. Thầy em kể: ngày xưa lab thầy, hàng năm, cứ phải mời một chú người Hàn sang để biểu hiện protein XXX. Chủng có, thiết bị hóa chất đủ, người thì thừa, nhửng chỉ có chú Hàn biểu hiện được, thế mới lạ.

1. Ồ, hiểu nhầm hiều nhầm, ở trên là nói dùng 1 trong các cách chứ không phải áp tất cả các gạch đầu dòng nhé.

2. Đôi khi không tốt chứ không phải lúc nào cũng không tốt. Nhưng không hiểu sao bọn Tây nó publish ác thế. Đừng nói protocol, nhiều chủng, tế bào... làm cả năm trời mới xong mà xin cái bọn nó cho ngay!!!!! Sau đó nhóm đi xin có publish cũng chỉ để tên người cho ở cái góc bé tí không mấy người đọc là "Acknowledgements". Khó hiểu.

Không nhằm đến chú Chi nhưng nhiều khi nghĩ mãi không hiểu sao tại Việt Nam hầu như giữa các lab hầu như không bao giờ chia sẻ vector (original vector thôi chứ chưa nói đến cloned vetor), bacterial strains...., protocols. Nhiều khi mượn 1 bài báo hay cuốn sách đi photo cũng cực kỳ khó khăn.Có lẽ cũng tại thế nên mỗi cái việc biểu hiện protein cỏn con cũng phải mời thằng Hàn chăng?

Nói vậy thôi chứ bác viet23ht sướng nhé, chuyên gia thực thụ ra mặt rồi, bác liên hệ ngay rồi còn cưa đôi 500$ hehe.

 

[viet23ht]

ti thể

He he, cảm ơn chú Hưng nhé.
Khích tướng mãi cuối cùng cũng tìm được rồi.
Đúng như chú nói, ở Việt Nam chia sẻ thông tin là khó khăn.
Anh đang chạy thử nghiệm mini STR, thành công thì không ngó đến ti thể nữa.
Tại sao ư? Lý do mà dự án nhiều người theo đuổi cuối cùng không được bộ KHĐT duyệt. Nói thế chắc chú hiểu.
Thứ nhất giá nó quá đắt, thứ 2 để làm được thì những người như "chú Hàn" kia thì "hơi hiếm". Bọn anh trước đây vẫn nhằn món này mà, hóc cũng phải nhằn, vẹo hết cả hàm ấy chứ. Nhân lực không đủ chiến, mà còn phải làm trăm thứ bà rằn nữa nên nhiều khi không thiết.
Đến thằng Úc ngon lành thế mà khi hỏi có làm mt ko, nó lắc đầu.
Mình hỏi tiếp thế thì khi cần mày làm thế nào? Nó bảo gửi sang Mẽo, 1000/mẫu. Keke, thế là ở mình rẻ hơn nhiều, sang chỗ Chi thì còn rẻ hơn nữa.
Nói vậy thôi, có gì thì chuyển qua Chi mần nhé

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Nó làm thế không phải vì nó tốt mà vì nó "professional" trong chuyện này rồi: tự do phát tán tri thức mà.
Nhưng nếu 2 kình địch với nhau (vì lý do cá nhân hay công việc) thì chưa chắc nó cho đâu nhé.
Có lẽ ở VN mình thấy đâu đâu cũng là "kẻ thù"

 

[Lê Đức Dũng]

Nó làm thế không phải vì nó tốt mà vì nó "professional" trong chuyện này rồi: tự do phát tán tri thức mà.
Nhưng nếu 2 kình địch với nhau (vì lý do cá nhân hay công việc) thì chưa chắc nó cho đâu nhé.
Có lẽ ở VN mình thấy đâu đâu cũng là "kẻ thù"

cũng tại vì đặc điểm lịch sử cả.. do chiến tranh liên mien nên người vn rất hay đay nghi và cảnh giác nhau...

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Ối bác viet23ht ơi sao bọn nó phân tích giá rẻ thế........

Những kẻ giết người như McKinney rất sợ bị phân tích gene. Điều này có nguyên do của nó: Trên lý thuyết, người ta chỉ cần một lượng máu, mồ hôi, nước bọt, tinh trùng rất nhỏ hay một vài phần tử da, một cọng tóc rơi để dựng lên "tiểu sử" của một cá nhân. Chi phí tối đa vào khoảng 50 euro.
http://vnexpress.net/GL/Khoa-hoc/2008/10/3BA07927/

 

[viet23ht]

Đúng rồi

Keke, anh vừa đọc xong, đấy là phương pháp phân tích đoạn lặp, không phải giải trình tự tưng nu. Mà chú chắc chưa được giao mua hóa chất ở Việt Nam à, đùa thôi, ở VN thì mọi thứ đều đắt hơn khi mua ở EU hoặc nơi khác