Vấn đề khi PCR plasmid tái tổ hợp cần được giải đáp

[sugie]

Xin chào. S gặp vấn đề như sau mong mọi người có thể giúp :
S đang làm đề tài xây dựng đường chuẩn qPCR cho 2 gen chống oxy hoá trên cây.
Sau khi ly trích plasmid và chạy PCR thì kết quả điện di (ảnh đính kèm) cho hàng loạt vạch 100, 200, 300, 400 bp,.. đủ cả, mỗi gen ra các vạch khác nhau, đậm nhạt khác nhau Trước đó kết quả PCR khuẩn lạc vẫn cho 1 vạch duy nhất như khi PCR mẫu DNA bình thường, gen 1 200 bp và gen 2 150 bp. Vậy nguyên nhân có thể là gì mong mọi người giải đáp.
Chúc ngày vui (chớ S đang rầu lắm) .

 

[Giaptrinh]

Chào bạn,
Có thể bạn bị nhiễm tạp gDNA trong mẫu plasmid.
Khi bạn PCR từ khuẩn lac, bạn gia nhiệt và rung mạnh nó giúp phá vỡ tế bào giải phóng plasmid nhưng điều này làm đứt gãy mạnh gDNA dẫn tới ít sản phẩm hơn PCR hơn.
Mình nghĩ sau khi tách plasmid, bạn nên điện di để tách gDNA rồi PCR lại thử xem.
Chúc cuối tuần vui vẻ!

 

[sugie]

Chào bạn,
Có thể bạn bị nhiễm tạp gDNA trong mẫu plasmid.
Khi bạn PCR từ khuẩn lac, bạn gia nhiệt và rung mạnh nó giúp phá vỡ tế bào giải phóng plasmid nhưng điều này làm đứt gãy mạnh gDNA dẫn tới ít sản phẩm hơn PCR hơn.
Mình nghĩ sau khi tách plasmid, bạn nên điện di để tách gDNA rồi PCR lại thử xem.
Chúc cuối tuần vui vẻ!

Ơ, S chưa hiểu lắm ạ :bithuong::
-Vậy tức là phải tinh sạch lại mẫu plamid lần nữa hay sao, vì kết quả điện di plasmid ly trích vẫn cho 1 vạch bình thường sau đó S mới làm PCR plasmid?
-Với lại kết quả điện di này cho thấy 0 có vạch sản phẩm mong muốn là 150 và 200 bp.
-Có thể ly trích lại mẫu plasmid đã ly trích này 0, vì S 0 có kit hay đủ hoá chất tinh sạch sản phẩm điện di.
-Mà sử dụng kit cũng 0 thể đảm bảo sạch gDNA ạ (nó tên là Wizard® Plus SV Minipreps DNA purification system kit)?
Cám ơn rất nhiều!

 

[Giaptrinh]

Chào bạn,
Trước bạn nói thì mình chưa thấy bạn có bước điện di, vậy có thể nhiễm gDNA. Nhưng nếu bạn điện di rồi thì vấn đề phức tạp đấy .
Theo mình bạn nên:
- Pick một khuẩn lạc positive khác rồi nuôi và tách lại Plasmid, khi tách bạn chú ý mix nhẹ nhàng nhất để tránh contaminated gDNA.
- Trước thì mình dùng kit của Omega (E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit I) thì thấy tách loại gDNA cũng OK.
Tốt nhất và chính xác nhất là bạn nên gửi plasmid và cặp mồi bạn PCR đi giải trình tự là bạn sẽ có câu trả lời vì sao.
Hy vọng bạn có thể tham khảo!

 

[Mainguyen]

Theo như mình đọc hiểu thì quá trình bạn làm ntn: tách chiết DNA Plasmid bằng kit Promega=> điện di xuất hiện 1 band=> chạy PCR ra nhiều band nhưng lại không có band mong muốn. Một số trường hợp khả quan nhất có thể xảy ra như sau:
1. DNA tách chiết được chất lượng kém, có thể bị đứt gãy ngay vị trí đoạn gene mong muốn. Giải pháp: kit Promega khá tốt nên bạn cần kiểm tra lại thông tin kit có phù hợp với mẫu mình không và thao tác tách chiết của mình để tìm ra nguyên nhân. Nếu bạn muốn an tâm hơn thì bạn có thể dùng kit chất lượng hơn nữa. Hiện tại có kit MN (Đức) và kit QIAGEN (Đức) được đánh giá tốt hơn, tương đồng với nhau nhưng của MN giá tốt hơn. Nếu bạn cần mình sẽ giới thiệu người liên hệ để bạn có giá tốt.
2. Mồi trong phản ứng thiết kế không đặc hiệu, nó có thể bắt được đoạn gene trên Plasmid mình muốn nhưng cũng có thể bắt được các đoạn gene nằm trên Plasmid không mong muốn hoặc ở NST của gDNA. Giải pháp: thiết kế lại mồi đặc hiệu.
3. Trường hợp xấu nhất: đối tượng mình nghiên cứu không có đoạn gene mình mong muốn, bạn cần kiểm tra lại