What's new

qui trình ly trích cây dâu.

Dâu hạ châu là một loài cây ăn trái đặc sản của huyện Phong Điền _ Cần thơ. Hiện em đang làm đề tài về loại cây này. Đề tài của em "ứng dụng marker phân tử để chọn giống dâu Hạ Châu thuần" . với các bước ly trích như sau:
Các bước thực hiện

Bước 1: mô lá cắt nhỏ được nghiền bằng đủa thủy tinh trên đĩa với 400 ml dung dịch trích DNA (Extraction buffer) đến khi dung dịch có màu xanh ( do diệp lục bị vỡ sẽ phóng thích DNA).

Bước 2: thêm 400 ml dung dịch trích, trộn đều, lấy 400 ml cho vào tube với thể tích 1,5 ml đã được ghi nhãn. Ủ trong tủ ấm trong 10 phút ở 65 độ C có lắc đều.

Bước 3: thêm 400 ml chloroform: isopropanol (24 : 1), lắc nhẹ và đều. Ly tâm 30 giây ở tốc độ 13.000 vòng/phút.

Bước 4: rút cẩn thận 400 ml dung dịch nằm trên (tránh trộn lẫn với dung dịch bên dưới) sang tube 1,5 ml khác đã ghi nhãn. Ủ trong tủ ấm trong 10 phút ở 65 độ C có lắc đều.

Bước 5: thêm 800 ml ethanol 100 % ( cồn lạnh), trộn thật kỹ. Ly tâm 3 - 5 phút ở tốc độ 13.000 vòng/phút. Đổ bỏ phần supernatant.

Bước 6: rửa DNA với cồn 70 % ( cồn lạnh) và phơi khô khoảng 1 giờ đến 1,5 giờ ở nhiệt độ phòng.

Bước 7: hoà tan DNA với 50 ml dung dịch TE (Tris - EDTA). Trữ mẫu ở nhiệt độ 4oC.

Ghi chú:

Dịch trích DNA:

CTAB 4g

Tris 20ml

EDTA 0.5M 8ml

NaCl %M 16,4g

2 meraaptoethanol 2ml

H2O 200ml

TE Buffer:

Tris (ph=8) 10mM 0,5ml

EDTA (ph=8) 0.5M 0,1ml

H2O 49,4ml

nhưng hiện nay em đang gặp khó khăn là:
- sản phẩm sau khi cho TE và trử ở 4 độ C thì nó bị đông lại và khôg còn dịch để load mẫu lúc chạy điện di.
- khi để một thời gian ( khoảng 1 tuần) thì chúng chuyển sang màu đen và giống như là có những chất lơ lững trong đó.
- sản phẩm sau khi chạy điện di thì thường bị nhiễm nên có những vệt sáng rất dài ( hình), nên không dùng để chạy PCR được. đây là trở ngại lớn nhất.

Hiện nay em không còn nhiều thời gian để thử nghiệm các qui trình khác, rất mong các anh có thể giúp em khắc phục những vấn đề trên.
và hiện em đang làm về RAPD nhưng chưa đủ tự tin về cái này lắm, anh nào có tài liệu về cái này thì cho em xin, em cám ơn nhiều.
Email của em: hien1986b@gmail.com
 

Attachments

  • san pham chay dien di.jpg
    san pham chay dien di.jpg
    75.2 KB · Views: 8
A. Bạn có thể chiết lại như sau:

Bước 7: hoà tan DNA với 50 ml dung dịch TE (Tris - EDTA). Trữ mẫu ở nhiệt độ 4oC.

Bước 7.1: dẫn nước đến 500 ul, bổ sung 500 ul dung dịch phenol hoặc phenol: chloroform: isoamyl (25:24:1). Nếu không có 25:24:1 bạn có thể sử dụng 24:1.

Bước 7.2: ly tâm 13000 rpm trong 15 phút.

Bước 7.3: hút pha trên, tủa lại bằng EtOH hoặc isopropanol, nhớ bổ sung ion 1+.

Bước 7.4: ly tâm 13000 rpm trong 10 phút.

Bước 7.5: rửa lại bằng EtOH 70% (làm 2 lần thì tốt hơn).

Bước 7.6: ly tâm 13000 rpm trong 5 phút.

Bước 7.7: pha loãng DNA bằng 100 ul TE.


B. Hoặc bạn có thể tách lại và thay đổi:

1. Dùng dung dịch phenol hoặc 25:24:1 để chiết lần đầu

Dùng dung dịch 24:1 để chiết lại

Tăng thời gian ly tâm lên 10-15 phút.

2. Rửa DNA bằng EtOH 70% trong 2 lần.

3. Tăng lượng TE pha DNA lên 100 hoặc 200 ul.

***. Chú ý:
- Sử dụng phenol pH >=8 (chuẩn bằng Tris pH >8).
- TE dùng để pha DNA có thể ức chế phản ứng PCR.
 

Facebook

Top