Đổ gel thế nào mới đúng ?

[Quách Thu Hương]

em xin phép xóa

 

[Nguyễn Đôn]

Tui làm cái này theo tay quen thôi, thầy cô hồi đó có chỉ bài bản nhưng tui chỉ nhớ ý chính nên không rõ từng bước như bạn mô tả.

- Nồng độ agarose pha trong gel: Cái này tùy theo mục đích thí nghiệm, kích cỡ đoạn DNA mà bạn muốn phân biệt. Nếu các đoạn DNA của bạn không khác nhau nhiều thì bạn phải đổ gel có nồng độ agarose cao để có độ phân tách rõ hơn. Thường thì tui làm ở khoảng 0.8 - 1%. Nồng độ agarose cao thì thời gian để agarose tan trong đệm TAE lâu hơn.

- Khi cho bình erlen có dung dịch đệm TAE và agarose vào lò vi sóng, bạn có thể dùng một miếng khăn giấy nhỏ đậy ở miệng erlen để giảm độ bốc hơi, khi chạy trong lò vi sóng lâu mà dung tích không bị giảm nhiều.

- Tui chưa hiểu lắm việc cho EtBr vào thạch đang nóng mà bị tạo vẩn, có thể dung dịch EtBr của bạn quá loãng nên phải cho nhiều nên dung dịch agarose mới bị tạo vẩn??? Bạn nên làm dung dịch EtBr đậm đặc, chỉ cần cho một lượng rất nhỏ vào thạch, khi cho vào thì lắc đều tay, dung dịch sẽ không tạo vẩn.

Tui nghĩ không nên cho EtBr vào khi dung dịch agarose còn đang nóng, vì EtBr không bền nhiệt. Sau khi agarose tan hoàn toàn trong TAE, tui thường để khi nào dung dịch nguội bớt (sờ tay vào bình erlen mà không bị bỏng) thì mới cho EtBr vào, vừa cho vừa lắc đều tay.

Khi cho EtBr vào và đã lắc đều thì tui đổ ngay vào khay, dùng đầu tip nhựa của pipette để "chích" cho vỡ mấy cái bong bóng hay bọt tạo thành trong quá trình đổ, rồi cắm lược vào. Nếu bạn làm như tui thì coi như đổ gel lúc nó đã nguội bớt (không phải nóng hừng hực) nhưng chưa nguội lạnh.

Nếu bạn để dung dịch agarose nguội lạnh rồi mới đổ thì dễ có bong bóng tạo thành, bong bóng cũng to hơn và khó "chích" vỡ hơn, lúc này agarose cũng quá nguội nên sự phân bố của gel có thể không đều (gel trong khay sẽ có một đầu cao với nhiều gel hơn, còn đầu kia thấp do gel chưa chảy đều đến nơi thì đã đông cứng mất tiêu).

Nếu bạn làm theo cách nhuộm EtBr sau khi chạy gel thì không cần phải chờ cho dung dịch agarose nguội bớt rồi mới đổ. Theo kinh nghiệm cho thấy thì nếu trong quá trình gel đang đông mà bị rung lắc (mình sợ không đông cứ cầm nghiêng qua nghiêng lại để thăm chừng) thì nó càng lâu đông.

Đây là kinh nghiệm cá nhân của tui. Nhờ các anh chị và các bạn bổ sung thêm!

 

[Nguyễn Đôn]

- Thời gian agarose tan trong TAE: Ý tôi là thời gian bạn phải để bình erlen trong lò vi sóng.
- Về việc pha EtBr: Tôi thường pha từ bột EtBr (vô cùng độc hại, ặc ặc!!!), trữ trong lọ thủy tinh nhỏ màu đen ở nhiệt độ phòng. Mỗi lần pha tôi xài vài tháng, sau đó pha cái khác, không cần phải trữ trong tủ lạnh.
- Về "công nghệ" đổ thạch nguội mà tôi đang xài: Tôi chờ nguội bớt (chứ không phải nguội ngắt) rồi cho EtBr vào để EtBr không bị phân hủy vì nhiệt. Lúc đó tuy không còn bỏng tay nhưng vẫn còn rất ấm nên khi đổ vào khay sẽ không có nhiều bong bóng. Những bong bóng này rất dễ giải quyết bằng đầu tip nhựa của pipette.

Việc đổ gel agarose này có rất nhiều xì-tin khác nhau, nếu bạn mới bắt đầu thì cứ làm thử một vài kiểu. Sau một vài lần kiểm tra thì chắc chắn bạn sẽ quen tay và biết mình nên làm kiểu nào.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Thường thì mình làm như sau:

1. Nguyên liệu:
- EtBr dạng dung dịch mua sẵn của Biorad, nồng độ 10mg/ml thì phải.
- Agarose dạng bột
- Đệm TAE

2. Tiến hành:
- Cân Agarose vào bình tam giác
- Thêm TAE sao cho đúng nồng độ thiết kế
- Cho vào lò vi sóng "quay" tại nấc 900 tới khi sôi (độ 2 phút tùy theo thể tích đem "quay")
- Trong thời gian này lắp lược
- Khi Agarose sôi, chuyển lò vi sóng về nấc 600 (để tránh bị trào), đun tiếp đến khi dung dịch trở thành trong suốt (thường từ 3-5 phút tùy theo thể tích đêm "quay")
- Trong thời gian này mở sẵn bể điện di, đặt nguồn điện
- Sau khi dung dịch trong suốt lấy ra, dùng vòi nước lạnh xối vào bình cho tới khi áp tay vào mà vẫn chịu được (nhiệt độ khoảng 50 độ)
- Cho 1 µl EtBr (thường thì cho dù thể tích dung dịch Agarose là 40ml hay 100ml tôi cũng đều dùng 1µl EtBr), lắc đều
- Đổ dung dịch vào "khuôn", trích bọt bằng đầu tip như Đôn có nói.
- Để nguội trong 10 phút (trong thời gian này mix mẫu với loading dye).

Báo cáo hết.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Không biết ở các lab thì đổ EtBr vào trước phổ biến hơn hay để nhuộm sau phổ biến hơn nhỉ?

 

[Đỗ Lê Duy]

Không biết ở các lab thì đổ EtBr vào trước phổ biến hơn hay để nhuộm sau phổ biến hơn nhỉ?

Bình thuòng em làm ,thì với gel agarose có thể cho EtBr(BET) vào lúc chuẩn bị gel hoặc chạy electrophoresis xong rồi nhuộm đều được.Nhung vi EtBr độc nên thường cho vào lúc chuẩn bị gel luôn để tránh thao tác nhiều lần.
Còn đối với gel polyacrylamide thì chỉ nên nhuộm sau khi chạy gel vì EtBr ngăn cản sự polymerisation cùa gel polyacrylamide.
Thuòng thì em làm là vậy.ko bít anh chị nghĩ thề nào?

 

[Nguyễn Đôn]

Theo những gì tôi được "chứng kiến" tại nhiều lab và trong các môn đã được học qua thì thường người ta cho EtBr vào trước khi gel agarose đông. Một số người khác thì không làm thế, mà chạy điện di xong rồi mới cho gel vào bể dung dịch TAE có EtBr để nhuộm. Mỗi phương pháp đều có ưu, nhược điểm, tùy ai thích cách nào mà dùng.

- Nhuộm trước: Cách này trông có vẻ đơn giản hơn, cho một ít EtBr vào dung dịch agarose, không phải bày biện ra cả một hộp EtBr (nhỡ đổ thì chết). Khi nhuộm EtBr sẵn trong gel, nếu các bác chạy điện di giữa đường mà muốn thử xem mẫu acid nucleic của mình chạy có đẹp không thì có thể bốc gel ra mà cho lên bàn đèn cực tím để xem.
- Nhuộm sau: Cách này nhiều người cho là sạch hơn, vì sau khi chạy xong, bốc gel ra mới nhuộm, do đó bồn điện di không bị nhiễm vết EtBr (giảm diện tích nhiễm EtBr). Lúc đổ gel cũng không cần phải lo hơi EtBr bay vào mắt mũi gây độc. Nhưng nhuộm sau thì không thể nhìn gel giữa chừng được, ngoài ra còn nguyên nhân cản trở sự polymer hóa của acrylamide như bạn Duy nói (nếu các bác xài gel polyacrylamide).

Em thì lúc nào cũng dùng "công nghệ" nhuộm trước.

 

[Nguyễn Đình Cường]

Không ngờ chuyện chuẩn bị bản gel agarose lại có nhiều thắc mắc nhỉ. Xin góp chuyện 1 tí cho rôm rả.

Bạn Hương nói: "Em đổ gel nhưng không hiểu sao lúc chạy điện di lên toàn làm band bị run rẩy hay có hiện tượng kiểu như hạt gel chưa tan hết và băng bị chạy vát vếch lung tung" => có thể do gel chưa tan hết, đổ gel vào khay/ bể điện di lúc nóng hay lạnh quá... như các bạn đã thảo luận. Tôi bổ sung thêm: có thể agarose bạn dùng không được xịn, agarose của hãng nào vậy? đệm TAE/ TBE dùng để pha gel, để điện di, bể điện di có sạch không? Các điện cực của bể điện di có tốt không? DNA còn lẫn protein cũng là 1 nguyên nhân.


Còn về chuyện cho EtBr trước hay sau điện di. Tôi ủng hộ cách thứ 2, tức là điện di xong thì mới nhuộm bản gel trong dung dịch EtBr. Hồi ở IBT vẫn làm thế, sang đây thấy mọi người cho EtBr lúc đổ gel, làm theo, nhưng khi chụp bản gel thì không thu được ảnh đẹp: nửa bản gel gần cực âm sáng hơn phần còn lại gần cực âm. Được nghe giải thích là trong khi điện di EtBr di chuyển về phía cực âm, ngược với chiều chuyển động của DNA. Cuối cùng, quay lại cách truyền thống, chụp ảnh bản gel đẹp liền, khà khà.
Hơn nữa, với cách bổ sung EtBr vào gel agarose trước khi điện di có 1 số "yếu điểm" khác như:
+ nhiệt độ cao của gel có thể làm phân hủy EtBr;
+ không gian làm việc bị "dính" EtBr sẽ rộng hơn: nó có thể "dính" sang nhiều dụng cụ thí nghiệm (bể điện di, pipet, hộp đựng tip, eppendorf, bàn thí nghiệm...) và có thể đi vào cơ thể nếu như vô tình 1 lúc nào đó bạn không dùng găng tay mà cầm các vật dụng đó=> rất nguy hiểm cho mình cũng cho những người làm cùng;
+ vấn đề tiết kiệm: vd, bạn đổ bản gel 6 giếng nhưng chỉ tra mẫu vào 2-3 giếng, khi điện di xong bạn sẽ lười/ ngại cắt phần bản gel không dùng đến => lãng phí.

Tạm thời hết.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Hồi ở IBT vẫn làm thế, sang đây thấy mọi người cho EtBr lúc đổ gel, làm theo, nhưng khi chụp bản gel thì không thu được ảnh đẹp: nửa bản gel gần cực âm sáng hơn phần còn lại gần cực âm. Được nghe giải thích là trong khi điện di EtBr di chuyển về phía cực âm, ngược với chiều chuyển động của DNA. Cuối cùng, quay lại cách truyền thống, chụp ảnh bản gel đẹp liền, khà khà.

Mình không thấy hiện tượng này. Lúc nào bản gel cũng đẹp như mơ dù cho EtBr vào trước hay sau.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Để tiện các bạn khác giải đáp, bạn Hương nên post hình gel lên đây. (Một bức tranh tương đương ngàn chữ mà, phải không?)

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Trước hết bạn upload hình của mình lên một server ảnh như photobucket hoặc imageshack
Sau đó bạn copy url được tạo ra ở các trang web này và dán vào cửa sổ hiện ra khi bạn click vào biểu tượng Insert image trong textbox của forum này
Vấn đề ở đây là cái hình bạn đưa lên 'chẳng có vấn đề gì cả' nên làm sao các bạn khác có thể giúp được.

 

[Trương Xuân Đại]

Hic, khổ quá. Em cũng muốn post hình lên mà có được đâu. Em phải đặt link bài báo có hình kia kìa.

Bạn vô đây
http://www.imageshack.us/-->Browse----> chọn ảnhcần Upload (nhớ Open)--->Host it--->sau đó bạn copy nguyên Direct link to image dán vào bài của bạn đang soạn là được.
Đơn giản hơn bạn chọn chức năng tải file từ máy trong website. làm theo hướng dẫn.