Alkaline phosphatase assay.

[paltin]

Chào ace.
Mình làm thí nghiệm ALP trên tế bào osteoblast như sau.


1. Cell culture until cell density is about 90%
2. Seeding cell in 24 well-plate 2x10^4 cells/well/1ml on DMEM (10%FBS),
3. Remove medium and treat with sample in DMEM +10%FBS (500ul/well), incubate for 2 days; washing 3 times with PBS (500ul/well)
4. Add 100µl carbonate buffer 25mM (Na2CO3, NaHCO3) contain 0.1% Triton 100X, pipetting and take all solution to new eppendorf. Centrifuge at 13,000 rpm for 15min and change to new eppendorf.
5. Add 100µl carbonate buffer 25mM (Na2CO3, NaHCO3) contain 1.5mM MgCl2 and 1X pNPP (pNPP 5X: DW: carbonate buffer = 1:39:10) into 50ul solution
6. Incubate at 370C for 1h30
7. Transfer each 100µl cell solution into 96 well-plates.(transfer cell solution from eppendorf to well in 96well plate). Stop reaction with 50ul NaOH 1M for 10min at RT.
8. Absorbance at 405nm.


------> tuy nhiên sau khi thực hiện thì giá trị nhỏ dần đều theo nồng độ. (balnk 100%-sample 90%, 79%....)

AC nào cho biết tại sao không, mặc dù chất đó đã có người làm và đăng báo rằng nó tăng (tại mình đang test phương pháp, nhưng không hiểu sao nó lại giảm)

Thanks!

 

[cfareast]

Chào ace.
Mình làm thí nghiệm ALP trên tế bào osteoblast như sau.


1. Cell culture until cell density is about 90%
2. Seeding cell in 24 well-plate 2x10^4 cells/well/1ml on DMEM (10%FBS),
3. Remove medium and treat with sample in DMEM +10%FBS (500ul/well), incubate for 2 days; washing 3 times with PBS (500ul/well)
4. Add 100µl carbonate buffer 25mM (Na2CO3, NaHCO3) contain 0.1% Triton 100X, pipetting and take all solution to new eppendorf. Centrifuge at 13,000 rpm for 15min and change to new eppendorf.
5. Add 100µl carbonate buffer 25mM (Na2CO3, NaHCO3) contain 1.5mM MgCl2 and 1X pNPP (pNPP 5X: DW: carbonate buffer = 1:39:10) into 50ul solution
6. Incubate at 370C for 1h30
7. Transfer each 100µl cell solution into 96 well-plates.(transfer cell solution from eppendorf to well in 96well plate). Stop reaction with 50ul NaOH 1M for 10min at RT.
8. Absorbance at 405nm.


------> tuy nhiên sau khi thực hiện thì giá trị nhỏ dần đều theo nồng độ. (balnk 100%-sample 90%, 79%....)

AC nào cho biết tại sao không, mặc dù chất đó đã có người làm và đăng báo rằng nó tăng (tại mình đang test phương pháp, nhưng không hiểu sao nó lại giảm)

Thanks!

CHẲNG HIỂU GÌ CẢ.

Protocol bạn copy xác định hoạt tính thì rất chi tiết. Nhưng mỗi cái thí nghiệm của bạn thì mô tả sơ sài, chẳng hiểu mục đích so sánh cái gì.


Thí nghiệm nói thế như đánh đố.

Blank là cái gì? bạn muốn giá trị giảm dần theo nồng độ cái gì???

có gì khác biệt giữa Blank và mẫu không?

Viết lủng củng và thiếu rõ ràng như vậy, Nếu tôi biết tôi cũng chẳng trả lời. SORRY

 

[paltin]

CHẲNG HIỂU GÌ CẢ.

Protocol bạn copy xác định hoạt tính thì rất chi tiết. Nhưng mỗi cái thí nghiệm của bạn thì mô tả sơ sài, chẳng hiểu mục đích so sánh cái gì.


Thí nghiệm nói thế như đánh đố.

Blank là cái gì? bạn muốn giá trị giảm dần theo nồng độ cái gì???

có gì khác biệt giữa Blank và mẫu không?

Viết lủng củng và thiếu rõ ràng như vậy, Nếu tôi biết tôi cũng chẳng trả lời. SORRY

Đầu tiên cảm ơn bạn đã trả lời. Xin lỗi ace vì viết không được rõ ràng ^,^
Phương pháp này mình xác định khả năng biệt hóa xương (osteoblast differentiation) of tế bào osteoblast. Mục đích của mình là tìm chất có khả năng làm gia tăng emzyme ALP. Thí nghiệm này là xác định hoạt tính cua ALP.
Blank ở đây chỉ có cell được nuôi trong môi trường DMEM ko treat với mẫu.
Điều mình muốn hỏi là khi tính toán so sánh với blank (ở đây là 100%) thì mẫu có % giảm.

Cách tính của mình như sau: OD405 của mẫu/OD405 của blank x 100%

Thank all

 

[cfareast]

Đầu tiên cảm ơn bạn đã trả lời. Xin lỗi ace vì viết không được rõ ràng ^,^
Phương pháp này mình xác định khả năng biệt hóa xương (osteoblast differentiation) of tế bào osteoblast. Mục đích của mình là tìm chất có khả năng làm gia tăng emzyme ALP. Thí nghiệm này là xác định hoạt tính cua ALP.
Blank ở đây chỉ có cell được nuôi trong môi trường DMEM ko treat với mẫu.
Điều mình muốn hỏi là khi tính toán so sánh với blank (ở đây là 100%) thì mẫu có % giảm.

Cách tính của mình như sau: OD405 của mẫu/OD405 của blank x 100%

Thank all

everything is clear. Có vài khả năng sau:

- Thứ nhất là mẫu không có tác dụng kích thích tăng hoạt tính enzyme.
- Thứ nhì là mẫu của bạn ở nồng độ nào đó, ức chế cell growth nên blank cell intensity cao thì đương nhiên hoạt tính phải cao. Cái này nếu có thể, thì có thể kiểm tra cell viability bằng OD600 hay bằng mắt thường.

- Thứ 3 là mình chẳng hiểu enzyme nội bào hay ngoại bào... rửa ráy tùm lum. Bước 3 rửa 3x bằng PBS buffer, tức là tế bào bám đáy à? Bước 7 hút 100 cell solution, tức là mang cả dịch và cell đi đo OD405nm à???
Cái quan trọng nhất là phải xác định được enzyme là nội bào hay ngoại bào, có cần phải phá tế bào xác định không?
Bước 7 chắc protocol ghi thiếu, phải có bước ly tâm..., obtain supernatant only

good luck

 

[paltin]

Cảm ơn cfareast
Thứ nhất nếu không có tác dụng tăng hoạt tính sao hoạt tính lại giảm??? mình cũng không hiểu cái này.
Thứ nhì mình đã checked cell viabiality la ok ko có cytotoxic và ko có proliferation bởi MTT assay.
Thứ ba đây là emzyme nội bào vì sau khi lysis mình thu tế bào và đem ly tâm loại bỏ cặn. Sau đó checked concentration protein bởi BCA method.
MÌnh không biết tại sao lại giảm. Nên mới có thắc mắc, xem ai đã từng làm cái này biết được nguyên nhân tại sao.

Thank all

 

[cfareast]

Cảm ơn cfareast
Thứ nhất nếu không có tác dụng tăng hoạt tính sao hoạt tính lại giảm??? mình cũng không hiểu cái này.
Thứ nhì mình đã checked cell viabiality la ok ko có cytotoxic và ko có proliferation bởi MTT assay.
Thứ ba đây là emzyme nội bào vì sau khi lysis mình thu tế bào và đem ly tâm loại bỏ cặn. Sau đó checked concentration protein bởi BCA method.
MÌnh không biết tại sao lại giảm. Nên mới có thắc mắc, xem ai đã từng làm cái này biết được nguyên nhân tại sao.

Thank all

- Thứ nhất, nếu bạn làm MTT mà mẫu thử ko có cytotoxicity , coi như số lượng tế bào 2 mẫu blank và sample treatment là ngang nhau

- Mình chuyên về enzyme, nếu enzyme nội bào, thì thử hoạt tính kiểu gì nếu không phá tế bào? hay chất pNPP (chắc là cơ chất) chui vào tế bào, rồi phản ứng trong đó, rồi thì tiết ra chất gì đó ra ngoài a để đo OD à???
- Có đoạn bạn viết Lysis tế bào, thế có làm hỏng enzyme ko? hay là lysis sau khi phản ứng hay trước phản ứng?

Trong thí nghiệm ko thấy mô tả những phần này?

Tôi thấy thí nghiệm cũng đơn giản... nếu lặp lại vài lần mà ko tăng hoạt tính, thì tức là chất sample của bạn ko có tác dung induce enzyme production.

that all

 

[paltin]

Thanks!
Trong phần này là phá vỡ tế bào bạn ah, nhưng do mình ghi không rõ.
"Thứ ba đây là emzyme nội bào vì sau khi lysis (phá vỡ tế bào) mình thu dịch lysis và đem ly tâm loại bỏ cặn và thu dịch nổi. Sau đó checked concentration protein bởi BCA method. Mục đích đưa tất cả mẫu về chung nồng độ"
Buffer lysis chỉ phá vỡ tế bào, để giải phóng ALP ra ngoài.
Thank again. Mình đang thử mẫu khác xem do thao tác hay do mẫu.
Chúc bạn cuối tuần vui vẻ.

 

[truong369]

Quy về cùng số lượng tế bào đi bạn,
và như anh cfareast nói, bạn nên kiểm tra xem mẫu có ức chế tế bào mọc hay không.

 

[cfareast]

Quy về cùng số lượng tế bào đi bạn,
và như anh cfareast nói, bạn nên kiểm tra xem mẫu có ức chế tế bào mọc hay không.

Hehe, bạn ko theo dõi chủ topic trả lời à. Chủ topic đã làm 2 việc:

- Đã kiểm tra cytotoxicity, mẫu ko gây độc tế bào.
- Đã check protein concentration bằng BCA method, nên có thể ko cần quy về mật độ Tế bào

 

[truong369]

Lần sau sẽ rút kinh nghiệm, cám ơn a