Oligonucleotide shuffling

[Huỳnh Chấn Khôn]

Chào các anh chị,
Em có một vấn đề không được rõ lắm muốn nhờ các anh chị góp ý.
Nếu em thực hiện phản ứng PCR (oligonucletide shuffling - không có template) như hình vẽ, thì em nghĩ lả sau PCR, điện di trên gel sẽ ra kết quả là một đoạn smear kéo dài từ trên xuống (ý em là nhiều sản phẩm), nhưng có người lại cho rằng chỉ ra một band sản phẩm duy nhất. Em không có kinh nghiệm về dạng shuffling này nên nhờ các anh chị có kinh nghiệm chỉ giáo dùm.
À, 12 oligos là 12 primer em thiết kế để khuếch đại một đoạn gene 504 bp. Những dấu * trên primer là những vùng sẽ tạo đột biến ngẫu nhiên. ( em dùng spiked oligos).[hr:43fe0de775]

Em xin cảm ơn

 

[Luyện Quốc Hải]

Giới thiệu về kỹ thuật tái tổ hợp trong gen (DNA-shuffling)​

  Phương pháp tái tổ hợp trong gen (hay còn gọi là sexual-PCR, family shuffling) là một phương pháp được tiến hành invitro nhờ phản ứng PCR nhằm tạo ra một ngân hàng gen lai, qua đó người ta có thể lựa chọn các dòng gen phù hợp với mục đích nghiên cứu.
Phương pháp tái tổ hợp trong gen đã được ứng dụng thành công trong nhiều lĩnh vực như: chế tạo chất kháng sinh, vacxin, làm tăng hoạt tính của enzyme hay là tạo ra các protein có chức năng khác nhau từ các đột biến không có chức năng.
  Nguyên lý của phương pháp tái tổ hợp trong gen (được trình bày trên hình 1) là sự tái tổ hợp lại các dòng gen có độ tương đồng cao nhằm tạo ra các dòng gen có tính chất thay đổi, trên cơ sở đó ta chọn những dòng có hoạt tính tăng. Cụ thể, một tập hợp các đột biến của một gen, hoặc một họ các gen có độ tương đồng cao từ các sinh vật khác nhau hoặc được chọn lọc từ ngân hàng gen đã được tạo ra bằng phương pháp Error-prone PCR được sử dụng làm mẫu. Các gen này sẽ được cắt bằng Endonuclease (ví dụ: Dnase I) thành các đoạn nhỏ có kích thước khác nhau. Sau đó, các đoạn có kích thước phù hợp (khoảng ≈ 50 bp) sẽ được chọn để làm mẫu cho phản ứng PCR tự mồi (tức là PCR không sử dụng mồi, mà mồi (cũng là template) chính là các đoạn nhỏ đó). Giai đoạn gắn mồi trong phản ứng PCR tự mồi được tiến hành ở nhiệt độ gắn mồi thấp (khoảng 45-50[sup:96358d5788]0[/sup:96358d5788]C nhằm tạo điều kiện cho các sợi đơn tương đồng bắt cặp chéo với nhau và kéo dài. Sự bắt cặp chéo tương đồng và kéo dài của các đoạn được tiếp tục diễn ra ở các chu kỳ sau. Cứ mỗi chu kỳ thì kích thước trung bình của mỗi đoạn được dài thêm. Quá trình PCR được tiếp tục cho đến khi đạt được đoạn có kích thước bằng với kích thước chuẩn ban đầu. Với mong muốn đạt được kích thước chuẩn này, người ta thường gắn thêm vào 2 đầu gen một đoạn nucleotide để khi quá trình bắt cặp tương đồng và kéo dài đến đoạn nuleotide này thì dừng lại vì không có mồi tương đồng bắt cặp nữa.
 Sản phẩm của lần PCR tự mồi này được dùng làm mẫu cho phản ứng PCR có mồi nhằm làm tăng số lượng bản sao mong muốn. Cuối cùng, một ngân hàng gen lai được tạo ra với độ đa dạng cao. Trong ngân hàng gen này có thể có các tổ hợp gen mà ta mong muốn. Toàn bộ quá trình có thể được lặp đi lặp lại nhiều lần cho đến khi đặt được kết quả tốt nhất (hình 2).
Khuyết điểm: hiệu xuất để tạo ra các sản phẩm gen mong muốn còn thấp. Tỉ lệ các gen không được shuffling còn cao (giống với nguồn gen ban đầu).

Trên đây là kiến thức cơ bản về DNA-shuffling. Hiện tại, các nhà khoa học đã phát triển nhiều phương pháp mới để hạn chế các khuyết điểm trên. Hai trong số đó là Degenerate oligonucleotide gene shuffling (DOGS) (tài liệu kèm theo) và phương pháp thiết kế primer có chứa những vùng có thể tạo đột biến ngẫu nhiên (như Khôn đang làm)



Trở lại câu hỏi của bạn:
- Về mặt suy luận: nếu bạn chỉ chạy PCR 1 lần thì tạo ra một vùng smear (còn smear có kéo dài từ trên xuống dưới bản gel agarose hay không thì còn phụ thuộc vào nhiều thứ…..có thể kiểm tra bằng thực nghiệm. Vì lúc này sự bắt cặp của mồi là rất ngẫu nhiên).
- Nếu bạn dừng thí nghiệm ở đây thì chưa đi hết thí nghiệm. Bạn sẽ phải tiến hành PCR lần 2. Các bước thí nghiệm theo mình nghĩ sẽ như sau:
+ PCR lần 1 ----- chạy điện di và cắt ngay một vùng smear xung quanh kích thước mà bạn mong muốn làm template (ở đây là ≈ 500bp) (và thử thêm trường hợp lấy cả hỗn hợp PCR lần 1 làm template) --- PCR lần 2: ở lần PCR này thì chỉ cần dùng 1 cặp mồi ở 2 đầu gen (mà bạn đã thiết kế các điểm cắt enzyme giới hạn như hình vẽ). Về mặt lý thuyết, đến đây thì bạn có thể thu được sản phẩm gen mong muốn (nhưng cũng ko nhất thiết là phải ra một băng đâu nhé, thực nghiệm có thể sẽ ra vài băng).  
  Trên đây là một số góp ý cho thí nghiệm của bạn. Có điều lý thuyết vẫn là lý thuyết, cần có thực nghiệm chứng minh và bổ sung.
  Trong qua trình làm, nếu sáng tỏ được điều gì thì bổ sung vào đây.

Ở Việt Nam, có TS. TRƯƠNG NAM HẢI, phòng KTDT - Viện CNSH cũng đã từng làm DNA-shuffling.

Thân chào.

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Chào anh Hải,
Ở trường hợp cắt nhỏ đoạn gen sau đó tái tổ hợp thì lượng DNA cho vào phản ứng là 10-30ng/ul. Còn trong trường hợp thiết kế một loạt oligonucleotides như em thì nếu cho lượng DNA nhiều như vậy thì sẽ rất tốn kém (chi phí primer rất cao khi đặt mua với ?hàm lượng lớn). Theo anh thì trong trường hợp của em, cơ bản nên cho vào tổng lượng primer là bao nhiêu để có thể giảm tối đa chi phí. Kế hoạch của em là tổng lượng primer (14 primer) cho phản ứng sẽ là 1uM,theo anh như vậy có quá ít ko?

 

[Luyện Quốc Hải]

Xin chào
?Xin lỗi bạn là mình cùng không có điều kiện thực hành phương pháp này. Tuy nhiên, mình có thể góp ý với bạn như sau:
? Trường hợp cắt nhỏ gen thì cần ?lượng lớn như bạn nói có thể là do tỉ lệ các đoạn làm primer trong PCR tự mồi là thấp và hiệu quả tạo ra đoạn gen mong muốn là thấp, do đó cần tăng hàm lượng DNA Template.
? ?Tuy nhiên, trong trường hợp của Bạn đã được tối ưu, có định hướng và phản ứng bắt cặp của các đoạn với nhau là cao. Trong trường hợp này thì nồng độ của từng primer trong phản ứng sẽ giống (hoặc cao hơn 1 chút) với nồng độ primer bình thường (theo mình nghĩ vậy). Nên nhớ một điều, sản phầm PCR của các chu kỳ tiếp theo lại làm primer và template cho các chu kỳ tiếp theo nữa, do đó nồng độ primer ban đầu không cần phải quá cao như bạn nghĩ.
? Cuối cùng, bạn cần phải thiết kế thí nghiệm và tối ưu các điều kiện. Sau đó rút kinh nghiệm. Mọi người ở SHVN đang cần bạn chia sẽ kinh nghiệm thực tế vì bạn là người trực tiếp làm.
Thanks

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Em xin cảm ơn anh Hải vì những kiến thức anh chia sẻ và lời động viên của anh.
Học ở bên này nhiều lúc "bí", chẳng biết kiếm ai để thảo luận (vì chỉ có mình em là sinh viên nước ngoài trong lab), cũng may là được làm thành viên của SHVN, có cơ hội vào box để đặt câu hỏi và thảo luận với "các bậc tiền bối". Em xin chân thành cảm ơn các anh chị đã từng thảo luận cùng em những rắc rối em gặp phải trong quá trình làm thí nghiệm của mình. Cảm ơn SHVN nhiều nhiều !!!