Huỳnh Chấn Khôn
Senior Member
Chào các anh chị
Chúc mọi người đón một năm mới tràn đầy niềm vui và hạnh phúc
Hiện em đang clone một sản phẩm PCR (kích thước khoảng 520 bp) vào vector pET bằng 2 enzyme là ApaI và EcoRI.
Vì EcoRI và ApaI ủ ở nhiệt độ khác nhau nên em cắt vector và insert lần lượt bằng EcoRI (37 độ trong 4 giờ) rồi mới cắt tiếp bằng ApaI (25 độ 4 giờ hoặc ủ qua đêm). Em không biết thời gian 4 tiếng ủ enzyme như vậy có đủ không vì đối với trường hợp của em, em không thể nào xác định được insert đã được cắt hay chưa bằng điện di vì kích thước trước và sau khi cắt bằng nhau. Đối với trường hợp vector, lúc cắt lần đầu tiên thì em có thể phân biệt được band nào là band bị cắt, band nào là vector chưa bị cắt trên gel ( band chưa bị cắt sẽ có kích thước nhỏ hơn vì ở dạng supercoil).
Nhưng khi cắt đến enzyme thứ 2 thì bó tay vì 2 site cut này nằm kế nhau nên không thể dua75 vào kích thước để xác định được phản ứng cắt đã thành công hay chưa.
Em hỏi vậy là vì em là cloning 2 lần rồi mà thất bại ( sau khi ligation, kiểm tra đạn insert thì toàn thấy vector tự nối (self-ligated). Em có nghĩ đến việc xử lý vector bằng CIAP nhưng lại kẹt một cái là vector sau nhiều lần cắt enzyme, tinh sạch bằng clean up kit và gel extraction kit thì hàm lượng bị thất thoát rất nhiều nên không dám xử lý CIAP rồi lại tinh sạch nữa).
Anh chị nào có kinh nghiệm làm cloning nhiều giúp dùm em với. Cái thứ nhất là làm sao để chuẩn bị được vector với hàm lượng cao, thứ 2 là làm sao để biết được phàn ứng cắt enzyme như vậy đủ chưa, thứ 3 là thường sau khi ligation xong, các anh chị có điện di sản phẩm để kiểm tra trước khi chuyển nạp vô vi khuẩn không và dùng thể tích bao nhiêu ul để chuyền vào vi khuẩn? Ngoài ra, sau khi chuyển nạp thì trên đĩa petri sẽ thường có bao nhiêu khuẩn lạc?
Chúc mọi người đón một năm mới tràn đầy niềm vui và hạnh phúc
Hiện em đang clone một sản phẩm PCR (kích thước khoảng 520 bp) vào vector pET bằng 2 enzyme là ApaI và EcoRI.
Vì EcoRI và ApaI ủ ở nhiệt độ khác nhau nên em cắt vector và insert lần lượt bằng EcoRI (37 độ trong 4 giờ) rồi mới cắt tiếp bằng ApaI (25 độ 4 giờ hoặc ủ qua đêm). Em không biết thời gian 4 tiếng ủ enzyme như vậy có đủ không vì đối với trường hợp của em, em không thể nào xác định được insert đã được cắt hay chưa bằng điện di vì kích thước trước và sau khi cắt bằng nhau. Đối với trường hợp vector, lúc cắt lần đầu tiên thì em có thể phân biệt được band nào là band bị cắt, band nào là vector chưa bị cắt trên gel ( band chưa bị cắt sẽ có kích thước nhỏ hơn vì ở dạng supercoil).
Nhưng khi cắt đến enzyme thứ 2 thì bó tay vì 2 site cut này nằm kế nhau nên không thể dua75 vào kích thước để xác định được phản ứng cắt đã thành công hay chưa.
Em hỏi vậy là vì em là cloning 2 lần rồi mà thất bại ( sau khi ligation, kiểm tra đạn insert thì toàn thấy vector tự nối (self-ligated). Em có nghĩ đến việc xử lý vector bằng CIAP nhưng lại kẹt một cái là vector sau nhiều lần cắt enzyme, tinh sạch bằng clean up kit và gel extraction kit thì hàm lượng bị thất thoát rất nhiều nên không dám xử lý CIAP rồi lại tinh sạch nữa).
Anh chị nào có kinh nghiệm làm cloning nhiều giúp dùm em với. Cái thứ nhất là làm sao để chuẩn bị được vector với hàm lượng cao, thứ 2 là làm sao để biết được phàn ứng cắt enzyme như vậy đủ chưa, thứ 3 là thường sau khi ligation xong, các anh chị có điện di sản phẩm để kiểm tra trước khi chuyển nạp vô vi khuẩn không và dùng thể tích bao nhiêu ul để chuyền vào vi khuẩn? Ngoài ra, sau khi chuyển nạp thì trên đĩa petri sẽ thường có bao nhiêu khuẩn lạc?
. Khi cắt vector cũng thế, làm dư ra đỡ phải làm nhiều lần.
. Đã có rất nhiều người gặp problem với agarose, ko biết là do agarose hay EB khi run gel..v..v..., mọi người chỉ đồng ý đó là "something" in agarose disturbs ligation. Và nhiều khi là do từng batch agarose nữa, có thể là do độ tinh sạch của từng đợt sản phẩm nữa. Túm lại là ngoài các chú ý như các anh chị đã nêu trên, bạn nên hạn chế thôi gel. Có khi cắt insert ra khỏi cloning vector, em cũng ko thôi gel, tống thẳng vào vector thứ hai, vì chọn kháng sinh khác mà