Các yếu tố nào ảnh hưởng đến competent cell efficiency?

[Vân Hạ]

Xin chào các anh các chị và các bạn,
Tôi đang chuẩn bị tế bào khả biến của E.coli Top10 phục vụ để hóa biến nạp. Tuy vậy làm mãi vẫn chưa thành công. Khi biến nạp thử bằng pBSK có biết trước nồng độ plasmid, kết quả không thu được khuẩn lạc nào. Tôi đang làm bằng phương pháp sử dụng CaCl2 và MgCl2.
Mọi người có thể phân tích giúp tôi xem có những yếu tố nào gây ảnh hưởng tới kết quả nêu trên của tôi không?
Cảm ơn rất nhiều!

 

[cfareast]

Xin chào các anh các chị và các bạn,
Tôi đang chuẩn bị tế bào khả biến của E.coli Top10 phục vụ để hóa biến nạp. Tuy vậy làm mãi vẫn chưa thành công. Khi biến nạp thử bằng pBSK có biết trước nồng độ plasmid, kết quả không thu được khuẩn lạc nào. Tôi đang làm bằng phương pháp sử dụng CaCl2 và MgCl2.
Mọi người có thể phân tích giúp tôi xem có những yếu tố nào gây ảnh hưởng tới kết quả nêu trên của tôi không?
Cảm ơn rất nhiều!

Yếu tố con người bạn ạ!

Làm từ khâu tế bào đến trải đĩa thạch, có bao nhiêu khâu chuẩn bị, khâu nào cũng quan trọng, Kể cả pha môi trường, hóa chất, chuẩn bị plasmid....hỏng cái nào cũng đều dẫn đến thất bại.

Bạn hỏi vậy, biết trả lời sao??? Tóm lại... cứ đúng protocol mà làm

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Bạn đưa protocol của bạn cho mọi người tham khảo, đồng thời mô tả quy trình thì mới biết sai chỗ nào.

Bạn dò lại từng bước: tế bào còn fresh không (mới streak mới cấy), OD có đúng không (0.3-0.5)....v.v.

 

[Vân Hạ]

Tôi làm theo protocol như sau:

i. Preculture
Inoculate 5mL LB medium on a 50mL Falcon tube. (Steriled)
Grow over night at 370C and 220rpm
ii. Procedure
1. Inoculate 250uL of preculture with 200mL LB medium into a stiriled flash of 250-500mL. Add 1% glucose (1g to 100mL of LB). => 4mL (50g/100mL steriled glucose) of glucose to 200mL LB.
2. Let grow at 370C and 220rpm until the OD600=0.3 (blank by LB and normally culture in 2-3 hour).
3. Put on ice 30mn. Pre-cool down the cetrifugator in 40C.
4. Divide the supernatant into 4 falcon tubes and Centrifuge at 40C and 4000rpm during 15mn.
5. Add 25mL of cold 0.1M MgCl2 into the first falcon. Mix and transfer to the second. Do the same until the fourth falcon. (To gather the pellet and mix with MgCl2).
6. Put in ice for 10mn
7. Centrifuge at 40C and 4000rpm during 15mn.
8. Mix the pellet with 12mL of CaCl2/15% 0.1M glycerol cold.
9. Put in ice 30mn-1h.
10. Centrifuge at at 40C and 4000rpm during 15mn.
11. Mix the pellet with 2.5mL of CaCl2/15% 0.1M glycerol cold.
12. Aliquote in 50ul into eppendorf tubes.
13. Dive in liquid nitrogen and store in -80.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Thứ nhất trong protocol của bạn không lưu ý là phải streak cell từ stock vào 1 dĩa LB, rồi nuôi qua đêm, sau đó dùng 1 colony từ dĩa để nuôi trong 5ml LB lỏng. Thông thường tế bào nuôi mới như thế này sẽ khỏe mạnh hơn nên khả năng phục hồi cao hơn.

Thứ hai là để tránh tế bào của bạn mất khả năng biến nạp thì ống EP tube của bạn nên làm lạnh trước trong Nito lỏng

Thứ ba là thông thường bọn tôi phân tối thiểu 100 ul tế bào vào mỗi ống. 50 có vẻ ít quá. Mà bạn làm thể tích nhiều thế thì phân 100 ul vào mỗi ống bạn vẫn có cả trăm ống tế bào khả biến, xài bao giờ cho hết.

Cuối cùng protocol bạn dường như có thừa 1 bước (bước 8 hoặc bước 11). Trong các protocol tôi làm thì chỉ cần bỏ CaCl2/ glycerol vào để lanh trong đá xong là phân vào EP tube luôn.

 

[Vân Hạ]

Thứ nhất trong protocol của bạn không lưu ý là phải streak cell từ stock vào 1 dĩa LB, rồi nuôi qua đêm, sau đó dùng 1 colony từ dĩa để nuôi trong 5ml LB lỏng. Thông thường tế bào nuôi mới như thế này sẽ khỏe mạnh hơn nên khả năng phục hồi cao hơn.

Thứ hai là để tránh tế bào của bạn mất khả năng biến nạp thì ống EP tube của bạn nên làm lạnh trước trong Nito lỏng

Thứ ba là thông thường bọn tôi phân tối thiểu 100 ul tế bào vào mỗi ống. 50 có vẻ ít quá. Mà bạn làm thể tích nhiều thế thì phân 100 ul vào mỗi ống bạn vẫn có cả trăm ống tế bào khả biến, xài bao giờ cho hết.

Cuối cùng protocol bạn dường như có thừa 1 bước (bước 8 hoặc bước 11). Trong các protocol tôi làm thì chỉ cần bỏ CaCl2/ glycerol vào để lanh trong đá xong là phân vào EP tube luôn.

Chào anh Lương,
Cảm ơn anh rất nhiều vì đã quan tâm và trả lời cho tôi.
Đúng là trong bước preculture tôi sử dụng luôn streak cell từ trong stock glycerol với thể tích 5ul nuôi vào LB lỏng qua đêm luôn. Tôi sẽ thử lại với cách của anh để xem hiệu quả thế nào. Cảm ơn anh rất nhiều.
Trước khi aliquot tôi đã làm lạnh EP tube bằng đá lạnh khoảng 2h. Theo anh như vậy có đảm bảo hay không?
Vì thể tích CaCl2/Glycerol cuối cùng tôi dùng để mix là 2.5ml nên mỗi lần làm tôi có 50 ống EP chứa 50ul competent cells cho nên cũng không quá nhiều anh ạ. (Xài chừng hai tuần là hết nếu làm liên tục)
Còn về hai bước 8 và 11 chỉ lặp lại để đảm bảo loại bỏ hết MgCl2 trong tế bào thôi.
Mong anh chỉ giáo thêm

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Không hiểu sao bạn lại có cả MgCl2 vào đây.

Đây là 1 protocol đơn giản tôi đã làm và cho kết quả tốt:

1. Streak stocked cells on LB plate and incubate at 37 overnight

2. Inoculate a single colony into 5ml LB and culture overnight

3. Take 1ml of preculture to inoculate a 100 ml LB in a 500 ml flask for ~1.30h

4. Check OD600, stop culture when OD reach 3.8

5. Stand flask in ice for 30 min

6. Harvest cells into 2x50 ml Falcon tube at 4C (10 min/4000 rpm)

7. Resuspend cells with 5 ml of CaCl2. Mix by shaking gently

8. Store in ice for 30min

9. Centrifuge 3000 rpm for 10 at 4C to harvest cells

10. Add 1 ml of 0.1M CaCl2 + 20% glycerol (v/v). Mix by shaking gently

11. Stand the tube in ice while aliquote ~ 100 ul of competent cells into prechilled EP tube.

12. Store at -70

 

[truong369]

Không hiểu sao bạn lại có cả MgCl2 vào đây.

Quy trình e làm cũng có MgCl2. Nhiều lần em thấy sử dụng hỗ hợp MgCl2: CaCl2 (với nồng độ 20nM mỗi loại) trước khi rửa bằng CaCl2 100mM thì số khuẩn lạc sau biến nạp mọc ra nhiều hơn (nhưng k dám khẳng định có phải do MgCl2 k vì còn hàng trăm yếu tố khác ảnh hưởng)

Còn khi làm mà lười quá thì chỉ rửa một lần, các bước cũng giống như quy trình anh Lương vừa nêu, kết qua vẫn ra đùng đùng. Chỉ cần giữ lạnh mọi thứ và ly tâm nhẹ.