Hiện tượng khó lý giải khi cắt plasmid bằng enzyme giới hạn

[anhtrungbio]

Kính chào các anh chị em

Em đang cắt kiểm tra các plasmid có mang insert hay không nên em đã lựa chọn Bgl2 là enzyme chỉ có 1 điểm cắt duy nhất trong insert mà không cắt vector.

Về mặt lý thuyết nó sẽ tạo ra 1 băng có kích thước khoảng 9kb. Tuy nhiên, sau khi ủ ở 37 độ C, qua đêm thì kết quả thật khó hiểu: cả 8 mẫu plasmid em mang cắt đều chỉ tạo ra những vệt rất mờ kích thước vài trăm bp, hoặc không có dấu vết gì của DNA trên gel cả.

Sau đó em đã tiến hành PCR universal để nhân đoạn insert lên thì thấy có 6/8 mẫu dương tính, thu được đúng đoạn có kích thước lý thuyết. Tuy nhiên, kích thước chính xác của toàn bộ plasmid vẫn là 1 ẩn số. Do đó, em vẫn thích digest hơn.

Em thực sự ko thể lý giải nổi tình huống này. Các cao nhân cho em xin tý kinh nghiệm!!
Chân thành cảm ơn

 

[cfareast]

Bạn phải sure là mẫu kiểm tra plasmid có plasmid, thì mới đem đi cắt.
Cắt 2-3 h là okie, việc gì phải overnight.
plasmid saukhi cắt ko thấy băng, nhưng pcr lên vạch thì là bình thường, vì chỉ cần 1 vết DNa là lên băng.

Tóm lại là rất đơn giản. Nếu check gợi ý đó, mà ko được,thì phải xem từ A-Z, vì có rất nhiều khâu phải có chuyên môn cao, làm cẩn thận thì mới thiết kế thí nghiệm chuẩn.

 

[anhtrungbio]

Bạn phải sure là mẫu kiểm tra plasmid có plasmid, thì mới đem đi cắt.
Cắt 2-3 h là okie, việc gì phải overnight.
plasmid saukhi cắt ko thấy băng, nhưng pcr lên vạch thì là bình thường, vì chỉ cần 1 vết DNa là lên băng.

Tóm lại là rất đơn giản. Nếu check gợi ý đó, mà ko được,thì phải xem từ A-Z, vì có rất nhiều khâu phải có chuyên môn cao, làm cẩn thận thì mới thiết kế thí nghiệm chuẩn.

Chắc chắn là sau khi tách chiết và điện di plasmid để chọn lọc những plasmid khả dĩ, rồi sau đó em mới mang đi cắt chứ bác. Nên chắc chắn là trong mẫu có plasmid.

Em thấy lạ là hiện tượng này xẩy ra khá nhiều lần với các đoạn insert và các enzyme khác nhau. Chỉ có 1 số lần là em cắt ra các băng đúng như lý thuyết.

 

[anhtrungbio]

Em cũng đang định thử cắt 2h thôi để xem thế nào, liệu có khi nào cắt over night có dẫn đến hiện tượng này ko nhỉ?

 

[cfareast]

Em cũng đang định thử cắt 2h thôi để xem thế nào, liệu có khi nào cắt over night có dẫn đến hiện tượng này ko nhỉ?

cắt 2h thi chac chan được, ít nhất là ko mất plasmid.

Nếu ko được, thay enzyme.
Nếu ko được nữa, check lại các hóa chất, các khâu...

 

[tran van giang]

1. Nếu chắc chắn bạn nên PCR bằng mồi bao ngoài của Plasmid trước khi cắt,
2. Nên tinh sạch plasmid khi cắt, khi bạn để qua đêm mà điện di lại không thấy gì chứng tỏ DNA plasmid đã bị phá hủy bởi enzyme nào đó trong hỗn hợp.
3. Chỉ cần cắt 1h-2h là ok.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Kính chào các anh chị em

Em đang cắt kiểm tra các plasmid có mang insert hay không nên em đã lựa chọn Bgl2 là enzyme chỉ có 1 điểm cắt duy nhất trong insert mà không cắt vector.

Chào bạn.
Theo tôi thì bạn hơi "cầu kỳ" khi làm thí nghiệm screening. Theo tôi biết thì Bgl2 không phải là enzyme phổ biến, vì thế chắc nó đắt tiền.
Thông thường nếu trong insert không có các enzyme phổ biến như EcoRI, BamHI, SalI, SacI thì tôi sẽ dùng chính các enzyme đó digest, như vậy nó sẽ cắt ở vị trí multiple cloning site và cho ra 1 đoạn có kích thước bằng plasmid rỗng và 1 đoạn chính là insert luôn. Các enzyme này giá rẻ hơn rất nhiều so với enzyme của bạn đã chọn nên sẽ tiết kiệm rất nhiều.
Nếu trong insert có các enzyme phổ biến, bạn có thể vẽ ra restriction map (bằng vector NTI chẳng hạn) và xem xét xem liệu có thể sử dụng các enzyme đó để cắt được không. Ví dụ nếu là 2 cutter ở trong insert của bạn thì bạn vẫn có thể dùng nó để cắt miễn là kích thước đoạn cắt khác hoàn toàn các đoạn cắt có thể còn lại.
Trường hợp quá lằng nhằng (cắt nhiều, kích thước các đoạn cắt không khác nhau, khó phân biệt), thì bạn mới dùng đến các rare cutter, chẳng hạn 8 cutter như NotI.

 

[cfareast]

Kính chào các anh chị em

Em đang cắt kiểm tra các plasmid có mang insert hay không nên em đã lựa chọn Bgl2 là enzyme chỉ có 1 điểm cắt duy nhất trong insert mà không cắt vector.


Chân thành cảm ơn

Nói chung có nhiều enzyme để lựa chọn, sao lại phải chọn bgl2 có 1 điểm cắt thôi! Nếu có cắt đúng, thì cũng chẳng biết có insert đúng kích thước hay ko???, vì plasmid sẽ bị linear, tạo 1 băng thôi. Để biết có văng ra insert ko, tìm 2 enzyme ở trước và sau gene hoặc trong gen cũng được, miễn sao biết kích thước, và tiện cho so sánh.


Tóm lại là việc lựa chọn enzyme cắt là ko rõ ràng, và cả thí nghiệm cắt cũng ko chuẩn, vì mất hết plasmid.
Có nhiều thao tác cần kinh nghiệm, như pcr, chọn band, chuẩn bị vector, ligation... và cả chọn clones mang kiểm tra....

 

[anhtrungbio]

Chào bạn.
Theo tôi thì bạn hơi "cầu kỳ" khi làm thí nghiệm screening. Theo tôi biết thì Bgl2 không phải là enzyme phổ biến, vì thế chắc nó đắt tiền.
Thông thường nếu trong insert không có các enzyme phổ biến như EcoRI, BamHI, SalI, SacI thì tôi sẽ dùng chính các enzyme đó digest, như vậy nó sẽ cắt ở vị trí multiple cloning site và cho ra 1 đoạn có kích thước bằng plasmid rỗng và 1 đoạn chính là insert luôn. Các enzyme này giá rẻ hơn rất nhiều so với enzyme của bạn đã chọn nên sẽ tiết kiệm rất nhiều.
Nếu trong insert có các enzyme phổ biến, bạn có thể vẽ ra restriction map (bằng vector NTI chẳng hạn) và xem xét xem liệu có thể sử dụng các enzyme đó để cắt được không. Ví dụ nếu là 2 cutter ở trong insert của bạn thì bạn vẫn có thể dùng nó để cắt miễn là kích thước đoạn cắt khác hoàn toàn các đoạn cắt có thể còn lại.
Trường hợp quá lằng nhằng (cắt nhiều, kích thước các đoạn cắt không khác nhau, khó phân biệt), thì bạn mới dùng đến các rare cutter, chẳng hạn 8 cutter như NotI.

Sở dĩ em chọn Bgl2 vì nó chỉ cho 1 băng duy nhất nên đỡ mất công tính toán, chứ em cũng ko quan tâm đến nó đắt hay rẻ (vì được bao cấp mà ).
Em đã nghiên cứu lại và tìm ra nguyên nhân của việc mẫu bị smear hoàn toàn là do trong mẫu vẫn còn dư DNase. Do đó, em đã loại bỏ nó bằng phenol / chloroform extraction. Sau đó, em đã sử dụng cách của bác và đã thu được kết quả tương đối tốt.
Thank bác nhiều ạ.

 

[anhtrungbio]

Nói chung có nhiều enzyme để lựa chọn, sao lại phải chọn bgl2 có 1 điểm cắt thôi! Nếu có cắt đúng, thì cũng chẳng biết có insert đúng kích thước hay ko???, vì plasmid sẽ bị linear, tạo 1 băng thôi. Để biết có văng ra insert ko, tìm 2 enzyme ở trước và sau gene hoặc trong gen cũng được, miễn sao biết kích thước, và tiện cho so sánh.
Tóm lại là việc lựa chọn enzyme cắt là ko rõ ràng, và cả thí nghiệm cắt cũng ko chuẩn, vì mất hết plasmid.
Có nhiều thao tác cần kinh nghiệm, như pcr, chọn band, chuẩn bị vector, ligation... và cả chọn clones mang kiểm tra....

Kinh nghiệm thì làm sao mà em có được khi em mới chập chững được 2 tháng làm thí nghiệm??? Mà nếu có kinh nghiệm rồi thì khó có thể mắc lỗi đến mức cần hỏi các bác. Vì thế tận dụng kinh nghiệm của các cao nhân đi trước mới cần thiết chứ!!!

Em đã chứng minh được trong mẫu còn tồn dư DNase và đã tìm cách loại bỏ nó. Kết quả thu được khá tốt.

Cảm ơn các bác nhiều.