Tách Plasmid

[QcJun]

Hôm trước em mới dc làm cái thí nghiệm về tách plasmid từ vk E. Coli nhưng mà có một số điều e vẫn không hiểu rõ lắm , mong anh/chị giúp e với ạ
1.Lúc mà cho dung dịch có chứa NaOH vào để phá vỡ tế bào ra e thấy dung dịch có cái gì đó nhớt nhớt , đó có phải là tế bào chất bên trong ko hay là chất gì ?
2.Sau đó cho dung dịch có chứa axit vào để giảm PH , theo lý thuyết sẽ phục hồi lại DNA plasmid mà ko phục hồi DNA của chromosome. Cái đó thì e chịu , chả biết vì sao lại thế ?

 

[orion8x]

1. Dung dịch NaOH đc cho thêm vào cùng với SDS, là 1 chất làm biến tính protein. Cả 2, do đó phá vỡ màng tế bào, SDS làm biến tính protein, NaOH phá vỡ liên kết hydro của DNA tạo nên các mạch đơn DNA, các dạng này của protein và DNA đều ít tan tạo nên 1 dạng "nhớt nhớt" như e thấy.

2. Kg phải là dung dịch chứa acid, mà là muối có tính acid như là Kali acetate.
+ K+ có tác dụng kết tủa gốc -SD (SDS là Sodium Dodecyl Sulphate tan, nhưng Potassium Dodecyl Sulphate lai kg tan), gốc -SD này trước đó đã bám vào protein gây biến tính, do đó KSD sẽ làm cả khối protein kết tủa theo.
+ Gốc acetate nay có tính acid, sẽ trung hòa bớt pH trong dung dịch, tạo điều kiện cho các mạch đơn DNA (tất cả các loại DNA) kết hợp lại với nhau thành mạch đôi. Điều này khả thi với plasmid DNA vốn có cấu trúc ngắn, đơn giản. Chromosomal DNA thì khác, nó quá dài do đó sẽ hình thành các cấu trúc thứ cấp (secondary structrure) thay vì dính với nhau hoàn chỉnh như trước khi biến tính. Plasmid dsDNA lại dễ tan trong nước, còn khối "bầy nhầy" chromosomal DNA sẽ bị cuốn vào kết tủa protein, khi li tâm sẽ bị chìm xuống đáy.

 

[Đinh Duy Thành]

.............mà là muối có tính acid như là Kali acetate.
.........................
... Gốc acetate nay có tính acid ............

Có chút này hình như không chuẩn lắm.

 

[orion8x]

pH của dung dịch Kali acetate ~5.5 mà bạn
Nó kg trung hòa đc NaOH, nhưng với 1 lượng lớn muối này + với nồng độ rất thấp của NaOH (~0.1M), nó có thể làm giảm pH của toàn bộ dung dịch xuống tạo điều kiện cho DNA kết hợp thành dsDNA.
Ta vẫn có thể trung hòa NaOH bằng các dung dịch có tính acid mạnh hơn (HCl chẳng hạn), nhưng nó sẽ tạo ra môi trường acid cục bộ khi thao tác, dẫn đến DNA sẽ bị gãy (nick & break)

 

[Đinh Duy Thành]

pH của dung dịch Kali acetate ~5.5 mà bạn

Đồng ý với chuyện pH ~ 5.5 - nhất là với hóa chất mua của hãng, chỉ là mình muốn đính chính chút về hóa học thôi. Muối của gốc base mạnh và gốc acid yếu sẽ có tính base - và tính base đó là do gốc acetate quyết định.

Còn về pH, nếu chúng ta phải tự pha dung dịch từ hóa chất bột thì câu chuyện sẽ được kể như thế này:

Potassium acetate solution (3 M), pH ∼5.5
294 g potassium acetate (3 M final)
50 ml 90% formic acid (1.18 M final)
H2O to 1 liter
Store indefinitely at room temperature

Hoặc:

5 M potassium acetate 60.0 ml
glacial acetic acid, 11.5 ml
H2O, 28.5 ml

Tác dụng của dung dịch thì như Orion8x đã nói:

The acidic solution brings the pH to neutral, and the DNA strands can renature. The large chromosomal strands cannot rehybridize perfectly, but instead become a partially-hybridized tangle. Potassium acetate precipitates the SDS (with its lipids and proteins) from the solution. The SDS/lipid/protein precipitate traps the tangled chromosomal DNA. This creates the “white goop” that pellets after centrifugation. Only the plasmid DNA, small fragments of chromosomal DNA, and RNA remain in solution.

 

[orion8x]

Cảm ơn vì đã sửa.
Thực sự thì mình kg giỏi phần Hóa lắm, nhất là các khoản về conjugated base. Mình thấy pH= ~5.5 nên nghĩ nó có tính acidic ^^.

 

[QcJun]

a ơi , cái cấu trúc thứ cấp của DNA mà a nói là gì vậy. Mà DNA của plasmid dễ tan trong nước hơn là sao , phải chăng là DNA khi dc phục hồi lại thì tan trong nước còn khi bị phá vỡ rồi thì không tan ?

 

[orion8x]

vì DNA rất dài nên xác suất 1 mạch DNA tự tạo liên kết bổ sung với chính nó, và đoạn DNA ngắn này liên kết với đoạn DNA ngắn khác rất cao (râu ông nọ cắm cằm bà kia). Đại loại nó sẽ giống như thế này

phải chăng là DNA khi dc phục hồi lại thì tan trong nước còn khi bị phá vỡ rồi thì không tan ?

đúng roài!

 

[QcJun]

đúng roài!

Vấn đề là tại sao a ơi , DNA mạch đơn hay đôi nó đều phân cực hết mà

 

[orion8x]

Mạch đôi hay đơn, chúng đều đang ở trong môi trường có muối (Na+/K+), các ion này sẽ trung hòa điện tích âm ở PO3- của mạch DNA làm cho chúng trở nên ít tan trong nước.
Plasmid có dạng vòng kín nên sẽ khó khăn hơn, cần phải có nồng độ muối cao hơn và alcohol (điểm đẳng điện thấp hơn) mới bị kết tủa.
Có vẻ là khả năng tương tác với các ion dương (Na+/K+) của ssDNA lớn hơn dsDNA (tính lun plasmid). ssDNA bắt đầu kết tủa ở 0.3M Na+, trong khi công thức tách chromosomal DNA cần nồng độ muối lên tới 3M và có mặt alcohol mới có thể kết tủa.

 

[anhtrungbio]

Hôm trước em mới dc làm cái thí nghiệm về tách plasmid từ vk E. Coli nhưng mà có một số điều e vẫn không hiểu rõ lắm , mong anh/chị giúp e với ạ
1.Lúc mà cho dung dịch có chứa NaOH vào để phá vỡ tế bào ra e thấy dung dịch có cái gì đó nhớt nhớt , đó có phải là tế bào chất bên trong ko hay là chất gì ?
2.Sau đó cho dung dịch có chứa axit vào để giảm PH , theo lý thuyết sẽ phục hồi lại DNA plasmid mà ko phục hồi DNA của chromosome. Cái đó thì e chịu , chả biết vì sao lại thế ?

Bạn chủ thớt dùng protocol nào thế? Mình dùng protocol khác nên không hiểu rõ các bước mà bạn nêu.

 

[QcJun]

protocol là cái j

 

[orion8x]

Bạn chủ thớt dùng protocol nào thế? Mình dùng protocol khác nên không hiểu rõ các bước mà bạn nêu.

Classical alkaline lysis protocol, là nguyên bản đầu tiên tách plasmid, cũng là protocol đầu tiên bọn SV phải học khi tách plasmid ấy.

 

[anhtrungbio]

Classical alkaline lysis protocol, là nguyên bản đầu tiên tách plasmid, cũng là protocol đầu tiên bọn SV phải học khi tách plasmid ấy.

Tớ không dùng protocol này.
Trong protocol tớ dùng có sử dụng đệm STET (Saccarose, Triton X-100, EDTA, Tris-HCl); lysozyme để phá huỷ thành tế bào. Sau đó tủa plasmid bằng isopropanol và rửa bằng EtOH
Lần nào mình tách cũng đc lượng plasmid khá lớn, mình thấy cách này rất hiệu quả (từ E.coli DH5 alpha).
Thân

 

[nnguyenha]

Anh (chị) giúp em giải thích các bước của thí nghiệm, tác dụng các hóa chất sử dụng trong quá trình tách plasimid được không ạ ? Em đang học mà không hiểu gì