Vấn đề với cột sắc ký trao đổi ion

[JDung]

Xin chào các bạn.
Mình đang tách chiết và tinh sạch enzyme Xylanase trên 1 loại vi khuẩn Bacillus, cột sắc ký trao đổi ion mình dùng ở đây là dùng gel CM-Cepharose, đệm Acetate pH 6,8 0.05M, gradient NaCl 1M pha trong đệm acetate trên, tốc độ dòng 3ml/1phút, 40 phân đoạn.

- Lần thứ nhất, mình load 500 microlit dịch lên cột thì sau quá trình định lượng thấy xylanase ra ở phân đoạn 27,28,29 tức là chúng bám cột.

- Lần 2 mình load 1ml dịch lên cột thì thấy xylanase ra ở phân đoạn 2,3,4,5 và 26,27,28. Mình nghĩ là xylanase bị overload ở các phân đoạn 2,3,4,5 do mình load 1 lượng lớn.

- Mình thu các phân đoạn 2,3,4,5 tiếp tục đưa lên cột, lúc đầu khi đưa lên mình để cột chảy tự do, không dùng bơm. Kết quả là vẫn thấy xylanase ra ở phân đoạn đầu 2,3,4,5 và 26,27,28 (hàm lượng ở phân đoạn đầu 2,3,4,5 còn cao hơn).

- Mình tiếp tục đưa phân đoạn 2,3,4,5 lên cột và chạy lần nữa, và kết quả lần này là chúng ra hết ở phân đoạn đầu 2,3,4,5, các phân đoạn sau không thấy có xylanse nữa.

Hiện giờ mình thực sự rất bối rối không biết giải thích kết quả này như thế nào. Mình đã làm xylanase trên con vi khuẩn này rồi và đoán chắc đáng lẽ nó phải bám cột và chỉ bị đẩy ra ở phân đoạn 26,27,28 mới đúng.

Ai đã có kinh nghiệm chạy sắc ký trao đổi ion có thể giải thích giúp mình được không.

 

[cfareast]

Để cho chắc chắn, hạt gel phải làm chuẩn: nạp đủ điện.
Các lần chạy tiếp theo, không biết có cùng 1 gel hay ko?

Đầu tiên phải kiểm tra:
+ Có mấy loại xylanase trong mẫu
+ Xylanase bám ở pH nào?
+ Dò độ bám, dung tích hấp phụ của cột đối với mẫu. Load mẫu ít hơn độ bám 1 chút cho sure là ko bị overload.

mẫu 2, 3,4, 5 của bạn, có thể là 1 xylanase khác ko bám cột.
Hoặc, cột bạn ko còn tích điện nữa (do ko rửa và nạp lại)

Thế thôi

 

[JDung]

Để cho chắc chắn, hạt gel phải làm chuẩn: nạp đủ điện.
Các lần chạy tiếp theo, không biết có cùng 1 gel hay ko?

Đầu tiên phải kiểm tra:
+ Có mấy loại xylanase trong mẫu
+ Xylanase bám ở pH nào?
+ Dò độ bám, dung tích hấp phụ của cột đối với mẫu. Load mẫu ít hơn độ bám 1 chút cho sure là ko bị overload.

mẫu 2, 3,4, 5 của bạn, có thể là 1 xylanase khác ko bám cột.
Hoặc, cột bạn ko còn tích điện nữa (do ko rửa và nạp lại)

Thế thôi

Cám ơn bạn đã hỗ trợ.

Các lần đều chạy cùng 1 gel trên cùng 1 cột, chỉ khác nhau là trong khoảng thời gian giữa 2 lần chạy thì cũng có 1 người xài cột này, nhưng trước khi chạy mình đều đã rửa theo quy trình.

Do lần chạy đầu là gel mới nhất nên tốt nhất mình có thể khẳng định chỉ có 1 loại xylanase là loại bám cột.

Chắc có lẽ để cho sure thì mình thay gel, pha lại hết các đệm và dung dịch rửa.