What's new

Pcr

Em muốn hỏi các anh chị trên diễn đàn xem em nên làm thế nào. vấn đề là hôm đầu tiên em chạy PCR với chu kỳ nhiệt như sau 94oC - 4 phút, (94oC-45 giây, 55oC-45 giây, 72oC-1 phút 15 giây)* 35 chu kỳ, 72oC-10 phút. Mồi của em khoảng 22 nu, em làm thể tích 20 ul. Nhưng PCR thì kết quả xuất hiện nhiều band (đối chứng dương là plasmid vi khuẩn thì lên vạch rõ nét, còn các mẫu ADN thực vật xuất hiện nhiều vạch). Hôm sau em điều chỉnh lại chu kỳ (tăng nhiệt độ biến tính 96oC-4 phút, (96oC- 45 giây, 55oC- 60 giây, 72oC-1 phút 45 giây)* 35 cky; lần khác nữa em cũng điều chỉnh đôi chút mấy chu kỳ nhiệt này nhưng kết quả đều ko thấy vạch nào, kể cả plasmid. em không hiểu do nguyên nhân nào nữa.
 

Ho Huu Tho

Member
Bạn dùng enzyme nào, có thể nhiệt độ và thời gian biến tính của bạn làm giảm đáng kể hoạt tính của enzyme. Theo mình nên giữ nguyên điều kiện biến tính như thí nghiệm đầu tiên, chỉ điều chỉnh nhiệt độ và thời gian gắn mồi xem kết quả thế nào.
 
Cảm ơn bạn, mình dùng Tag của Zigma, cùng với buffer 10X (bao gồm cả MgCl2). Có lần mình cũng giũ nguyên các nhiệt độ, chỉ thay đổi nhiệt độ gắn mooif là 60 oC/ 60 giây nhưng vẫn ko có kết quả bạn ạ :(
 

Ho Huu Tho

Member
Enzyme Taq không bền với nhiệt độ cao lắm, half life của enzyme này ở 97.5° chỉ còn có 9', nên có thể việc tăng nhiệt độ biến tính lên 96° ảnh hưởng tới việc không có sản phẩm. Bạn có thể cân nhắc sử dụng chương trình chạy đầu tiên và điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi về 57-58° (60° trong lần chạy trước có thể quá cao). Mình nghĩ bạn nên chạy cả chương trình đầu tiên với nhiệt độ gắn mồi 55° để tiện so sánh.
 
Mình mới làm nên không có nhiều kinh nghiệm, cảm ơn những lời khuyên hữu ích của bạn. Sáng mai mình sẽ làm lại, kết quả thế nào mình sẽ nhắn lại nhé.
 
Mình định làm chu kỳ thế này bạn xem có ổn không nhé:
94oC-5 phút, (94oC-45 giây, 58oC-30 giây, 72oC-1 phút 15 giây)x35 chu kỳ, 72oC- 10 phút.
 

Ho Huu Tho

Member
Mình định làm chu kỳ thế này bạn xem có ổn không nhé:
94oC-5 phút, (94oC-45 giây, 58oC-30 giây, 72oC-1 phút 15 giây)x35 chu kỳ, 72oC- 10 phút.
Theo mình bạn chỉ nên thay đổi nhiệt độ gắn mồi, không nên thay đổi cả thời gian gắn mồi trong một lần làm thí nghiệm. Bạn có thể xem xét rút ngắn thời gian gắn mồi trong thí nghiệm sau. Nếu máy của bạn chạy được gradient thì nên thực hiện để nhanh chóng chọn được nhiệt độ gắn mồi thích hợp.
 
hi, cuối cùng cũng được rồi bạn Hồ HữU Thọ ah. Đúng là mình chỉ nên thay nhiệt độ gắn mồi thôi, Cảm ơn bạn nhiều nhé. Ah, bạn ccos tài liệu gì về Southern blot mà ko dùng phóng xạ không, nếu có thì chia sẻ giúp mình nhé. Cảm ơn bạn thật nhiều
 

Facebook

Top