Giúp em với. Về vấn đề enzyme cắt EcoRI.

[tvh122]

Hiện em đang làm tạo dòng bằng vector pGEM-T easy, chèn đoạn gen khoảng 200bp.
Em thực hiện phản ứng PCR Clony khuẩn lạc trắng cho kết quả khuếch đại đúng đoạn gen chèn.
Ly trích plasmid, chạy PCR kiểm tra, khuếch đại đúng đoạn gen chèn ( kích thước).
Trên plasmid pGEM T-easy có 2 site cắt của enzyme EcoRI, trên đoạn gen chèn của em không có site cắt. Khi em thực hiện cắt plasmid bằng enzyme EcoRI thì chỉ cho một băng sản phẩm là của vector pGEM - T easy, còn đoạn gen chèn thì biến mất.
Em không biết nguyên nhân tại sao nữa. Có ai làm về cái này rồi thì giải thích giúp em là tại sao như vậy được không.

 

[cfareast]

Hiện em đang làm tạo dòng bằng vector pGEM-T easy, chèn đoạn gen khoảng 200bp.
Em thực hiện phản ứng PCR Clony khuẩn lạc trắng cho kết quả khuếch đại đúng đoạn gen chèn.
Ly trích plasmid, chạy PCR kiểm tra, khuếch đại đúng đoạn gen chèn ( kích thước).
Trên plasmid pGEM T-easy có 2 site cắt của enzyme EcoRI, trên đoạn gen chèn của em không có site cắt. Khi em thực hiện cắt plasmid bằng enzyme EcoRI thì chỉ cho một băng sản phẩm là của vector pGEM - T easy, còn đoạn gen chèn thì biến mất.
Em không biết nguyên nhân tại sao nữa. Có ai làm về cái này rồi thì giải thích giúp em là tại sao như vậy được không.

Bạn phải sure là đoạn 200bp của bạn ko bị chạy vọt ra ngoài gel. Còn đã sure mà ko được, thì xem:
- Đoạn 200bp hơi bé, nên có thể trên gel ko nhìn rõ. Để cho sure, bạn nên load thật nhiều mẫu để chạy gel... Có thể sẽ thấy lờ mờ đoạn 200bp của bạn.
- Khi nào làm thế mà ko thấy, thì hãy cắt kiểm tra plasmid = 2 enzyme khác (flanking your insert) (EcoRi và 1 cái khác tùy chọn, sao cho văng ra đoạn kích thước tương đối, đừng bé quá).
- Còn vẫn ko được, thì trao đổi sau.

 

[truong369]

Bạn cfareast đoán đúng bệnh rùi đấy bạn. Cắt lòi cái gene ra khó thấy lắm.
Nếu bạn tách plasmid bằng phương pháp SDS-kiềm, khi hoà tan tủa DNA sau bước tủa cồn thì hoà ít hơn bình thường khoảng 1/2 hay 1/3 thể tích thôi.
Kiểm tra plasmid tách được bằng điện di agarose thì chỉ load 1 micro plasmid thôi, nhuộm thấy ra đậm thì ok. Vì nồng độ cao.
Tăng lượng plasmid với lượng enzyme cắt trong một phản ứng. Thể tích phản ứng khoảng 25 - 30 micro (chỉ cần enzyme, plasmid, buff. Khỏi thêm nước luôn)
Khi chạy điện di sp cắt, load mẫu nhiều nhất có thể được vô giếng.

Hy vọng sẽ ra vạch gene chèn...mờ mờ. Tuy nhiên, làm như vậy mắc một khuyết điểm là band plasmid sáng quá đáng, đôi khi lem nhem vì nhiều plasmid quá, gel tách không tốt.

 

[tvh122]

Mình xin cảm ơn cfareast và truong369, sau khi đọc comment của các bạn mình cũng đã làm lại và kết quả cũng ok rùi. hi hi