Thắc mắc thực nghiệm về biểu hiện và tinh sạch protein

[Cao Xuân Hiếu]

Các anh chị ơi,
Em đã thử thêm vào binding buffer và washing buffer 20%  Ethanol, 20% Glycerol, dùng tới 1M NaCl và thử giảm pH xuống còn 6.5 nhưng vẫn bị nhiễm protein tạp.Bó tay luôn. Anh chị còn biết cách nào khác hoặc chất nào khác có thể làm giảm tạp protein không?À, em có thử dùng 1% SDS, nhưng em không biết làm sao làm tan SDS trong buffer (em khuấy hoài mà nó không chịu tan, đun lên thì mới tan nhưng khi để trong tủ lạnh thì nó lại trở lại dạng không tan).
Anh chị đã bao giờ sử dụng SDS trong khi tinh sạch protein chưa?
Em cũng đã thử tinh sạch protein từ inclusion body, nhưng không hiều sao khi em bỏ resin vào thì protein của em không thể bám với resin, kết quả là lượng protein thu được rất thấp.(hình điện di có 8 giếng), với tứh tự giếng như sau: Marker-Lysate-Flowthroght-Eluates. Band protein ở flowthrough rất đậm chứng tỏ protein của em đã không thể bám vào resin nên bị trôi đi.
Anh chị giúp em với.

SDS bao giờ mà chẳng tủa ở nhiệt độ thấp, không ai giữ đệm có SDS ở 4oC hay on ice cả. Nếu em cho lượng SDS trong buffer cao thì khó làm protein bám được vào resin. Theo cuốn QIAexpressionist thì họ recommend nồng độ SDS ko quá 0.3%.

Tôi vừa làm thành công 1 quả tinh sạch băng tạp E.coli khi tinh sạch His-tag nên post lên đây mọi ng tham khảo. Bài toán là biểu hiện và tinh sạch 1 protein 110 kDa chứa His-tag ở trong chủng BL21. Trước đây khi cảm ứng IPTG phần lớn protein thường đi vào inclusion bodies, phần hòa tan nếu tinh sạch bằng Ni-NTA thì luôn có thêm band 50kDa và 100kDa.

Chiến lược mới là dùng lysis buffer có thành phần như Khôn post ở trên chứa 20 mM imidazole và 8M ure (tinh sạch điều kiện biến tính). Sau khi phá tế bào thì kiểm tra cặn thấy protein của mình ko còn nhiều ở inclusion bodies như trước nữa mà nằm ở dịch lysis.

Trộn dịch lysis với Ni-NTA (1h) và rửa = đệm 30 - 60 mM imidazole ko chứa ure. Tinh sạch theo kiểu bypass (ko dùng column vì thấy hiệu quả rửa tốt hơn) là trộn và ly tâm loại dịch trên eppi. Elution buffer chứa 160 - 300 mM imidazole không chứa ure (điều kiện native) và trộn trong vòng 4 h đến 6h để protein tan dần lại trong đệm. Ly tâm lấy dịch và điện di kiểm tra thì ko bị dính band 100 kDa còn band 50 kDa thì rất mờ. Dùng cutoff 50MWCO là có được sản phẩm ngon lành.

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Anh Hiếu post hình điện di protein của anh cho em xem được không? Em muốn xem cái hình có band tạp bị mờ của anh.
Thanks.

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Chào các anh chị,
Gần đây em gặp một khó khăn lớn về việc tinh sạch protein. Sau khi elute, protein của em bị đóng vón (aggregation) rất nhanh. Không biết có anh chị nào đã từng bị trường hợp này chưa xin chỉ giáo em với.

 

[Lê Tiến Dũng]

Chào các anh chị,
Gần đây em gặp một khó khăn lớn về việc tinh sạch protein. Sau khi elute, protein của em bị đóng vón (aggregation) rất nhanh. Không biết có anh chị nào đã từng bị trường hợp này chưa xin chỉ giáo em với.

cái này xảy ra nhiều.

1- Objective của thí nghiệm có thể sai, bạn định đột biến để tăng ái lực của protein với ligand? bạn cho biết ligand này có phải là ligand tự nhiên của protein đó không? Nếu câu trả lời là có, thì cơ hội để bạn có được một đột biến có ái lực mạnh hơn là rất thấp.

2- Rất nhiều proteins sau khi chỉ đột biến 1 acid amin thì không thể thực hiện việc folding to the rite conformation và dẫn đến (1) degraded bởi host, (2) inclusion body . .

Sau khi tinh sạch protein đột biến, trừ khi protein có hoạt tính enzyme và confirm được bằng hoạt tính enzyme, nên kiểm tra cái conformation của nó (so sánh với thể ko đột biến).

Hầu hết protein tái tổ hợp biểu hiện trong e-coli, đều có một phần, có thể nhiều có thể ít với từng batch biểu hiện, aggregated, khi bạn tinh sạch bằng phương pháp Hí-tag bạn vẫn có thể thu được fragtion này trong cái phần ko aggregate. Trong những trường hợp cần nghiên cứu chức năng chính xác, thì phần này cần được loại bỏ bằng bước sắc ký lọc gel, người ta gọi bước này là polishing. cái aggregated nó ko globular nên sẽ tách khỏi phần kia! Trong nhiều trường hợp phần aggregate chiếm đến 90% khối lượng protein bạn tinh sạch được! Nếu ko loại bỏ khi bạn tính toán hoạt tính enzyme của nó bạn thấy thâp (vì 90% này ko có hoạt tính) nhưng thực thế là cao.

 

[Nguyễn Thị Huyền Ngọc]

Hiện tại em đang tách Fc người đển tạo kháng thể đặc hiệu. Em đang gặp khó khăn trong việc tách Fc ra khỏi Fab, IgG, và một số protein huyết thanh (không bít là gì nữa). Các anh chị xin chỉ giáo dùm em với. Em cám ơn nhiều!

 

[thangnho_12]

ng u vai choung

 

[Cao Xuân Hiếu]

Mãi mới tối ưu được quy trình này 1 cách ưng ý

http://www.thuvienkhoahoc.com/tusac...từ_inclusion_bodies_trong_điều_kiện_biến_tính

 

[Nguyễn Trung Thành]

cái này là để thu protein biến tính thôi hả bác, hok thấy có bước refolding nhỉ. mà nói chung trong đa số trường hợp protein khó tinh sạch thì việc tinh sạch từ inclusion body là khá dễ dàng nếu chỉ cần protein biến tính nhưng cái quan trọng và khó là bước refolding vì phần lớn các thí nghiệm đều cần native protein (còn nguyên hoạt tính)

 

[sinhvienhanoi]

Thong thuong trong bacterial proteome, ngoai histag con co cai protein khac co chua cac nhom chuc tu do nhu SH, COOH.... co the tao lien ket phoi tri voi con nikel, do vay nhung tap chat nay contribute to backgound binding,
Khi tag mot protein boi 6His, thi lien ket phoi tr tao voi cot nickel co the chiu duoc dieu kien loc rua la 2M NaCl, 8M urea, va .... google co du het, lam theo dung nhu vay chac chan se ra duoc protein mong muon
Noi chung express mot protein khong phai la van de lon cua bay gio