Biểu hiện protein ở E.coli?

[Nguyễn Ngọc Lương]

Có vấn đề thế này hỏi các chuyên gia E.coli ở đây xem sao:
+ protein có kích thước khoảng 46 kDal
+ biểu hiện ở nấm men không có vấn đề gì
+ biểu hiện ở E.coli dùng 2 loại vector là pCold (ở BL21) và pQE (ở M15) đều có hiện tượng: leakage & degradation. Không thấy rõ sự khác biệt giữa induction và non-induction. Leakage và degradation là suy ra từ Western bằng 3 loại antibody khác nhau (Histag và 2 antibody against 2 epitope khác nhau của protein này). 2 sequence được dùng trong thí nghiệm này. 1 là sequence gốc và 2 là 1 sequence đã codon optimized để biểu hiện ở thực vật.
Liệu trình tự có vấn đề gì? Hay bản thân protein có vấn đề? Lời khuyên của các chuyên gia là thế nào?
+ Khảo sát đk nuôi cấy (nhiệt độ, IPTG, OD)
+ Thử thêm vector nữa (lab còn thêm 1 vector nữa là pRSET)
+ Thay đổi toàn bộ hệ thống biểu hiện (cả vector lẫn host - tất nhiên là vẫn E.coli)

(Nếu cần picture sẽ upload theo yêu cầu)

 

[tran van giang]

Anh ah,

Anh ah,
Hồi trước em có biểu hiện với vector pET thì em thấy, khi em biểu hiện ở 37°C thì hiệu suất rất thấp và không khác nhau giữa cảm ứng và không cảm ứng. Sau đó em hạ nhiệt độ xuống 30, 25 va 20, thì em thấy ở 25°C là cho hiệu suất cao nhất đó em ah.
Chúc anh may mắn, anh khỏe không anh? Anh cho em xin cái mail của anh với, có gì em hỏi anh qua mail cho tiện.

 

[Cao Xuân Hiếu]

+ biểu hiện ở E.coli dùng 2 loại vector là pCold (ở BL21) và pQE (ở M15) đều có hiện tượng: leakage & degradation. Không thấy rõ sự khác biệt giữa induction và non-induction. Leakage và degradation là suy ra từ Western bằng 3 loại antibody khác nhau (Histag và 2 antibody against 2 epitope khác nhau của protein này). 2 sequence được dùng trong thí nghiệm này. 1 là sequence gốc và 2 là 1 sequence đã codon optimized để biểu hiện ở thực vật.
Liệu trình tự có vấn đề gì? Hay bản thân protein có vấn đề? Lời khuyên của các chuyên gia là thế nào?
+ Khảo sát đk nuôi cấy (nhiệt độ, IPTG, OD)
+ Thử thêm vector nữa (lab còn thêm 1 vector nữa là pRSET)
+ Thay đổi toàn bộ hệ thống biểu hiện (cả vector lẫn host - tất nhiên là vẫn E.coli)

(Nếu cần picture sẽ upload theo yêu cầu)

Kiểm tra xem có sự khác nhau đáng kể gì giữa clon pCoID và pQE k?
Tôi bắt bệnh leakage & degradation nhiều khả năng là do dùng high-copy number plasmid. Nếu vậy thì dùng pRSET ko có lợi ích gì. Giả định rằng nếu ta có thể vặn nhỏ mức độ biểu hiện đến 1 mức nào đó thì hạn chế được degradation.

Nếu có thể đi xin ở đâu đó hệ thống low-copy number plasmid khác hoặc dùng 1 plasmid khác để fine-tuning mức độ biểu hiện của T7-promoter (nếu có).

Hạ nhiệt độ, giảm IPTG, induce ở OD log cũng là 1 cách để giảm lượng biểu hiện.

 

[Lê Duy]

Cho em hỏi trường hợp chủng tăng sinh yếu đi sau khi cảm ứng bằng IPTG thì sao ạ?

 

[Cao Xuân Hiếu]

Cho em hỏi trường hợp chủng tăng sinh yếu đi sau khi cảm ứng bằng IPTG thì sao ạ?

vẫn cứ ktra xem có thu được band protein mong muốn k. Nếu có thì thử cảm ứng IPTG ở pha stationary (~ OD 0.8) và thu lượng lớn. Nếu k detect được band cảm ứng thì cần phải thêm thông tin cụ thể.

 

[Lê Duy]

Em đang tạo dòng gen mã hóa một protein có KL 7.5kDa. PCR plasmid tái tổ hợp bằng mồi đặc hiệu cho gen và mồi cho plasmid đều cho đúng kích thước. Nhưng khi biểu hiện ở chủng BL21(DE3) lại không thấy band overexpress. (em chạy Tricine-SDS PAGE).
Em có nên tạo dòng lại hay không a?

 

[Cao Xuân Hiếu]

Em đang tạo dòng gen mã hóa một protein có KL 7.5kDa. PCR plasmid tái tổ hợp bằng mồi đặc hiệu cho gen và mồi cho plasmid đều cho đúng kích thước. Nhưng khi biểu hiện ở chủng BL21(DE3) lại không thấy band overexpress. (em chạy Tricine-SDS PAGE).
Em có nên tạo dòng lại hay không a?

1. sequencing ktra construct de xem cac vi tri cat noi vao co chuan k.

2. thiet ke ban gel SDS-PAGE trong do sample va control chua cung 1 luong tuong duong de xem co band bieu hien nhung mu'c do. tha'p k?

 

[Lê Duy]

Em có đọc một số tài liệu thì người ta nói rằng, protein ngoại lai biểu hiện trong E. coli mà có trọng lượng phân tử thấp dưới 10kDa thì dễ dàng bị protease nội bào gặm. Em không rõ cơ chế vì sao protein phân tử lượng thấp lại dễ bị gặm như thế???