Xác định số lượng copy bằng Quantitative real time PCR

[Nchicken]

Các anh chị cho em hỏi đã có ai sử dụng phương pháp Quantitative real time PCR để xác định số lượng copy (gene inserted) chưa ạ?
Cụ thể là thế này ạ, gene của em được inserted vào genome của Arabidopsis thaliana, công việc của em là chọn dòng homozygous tương ứng có 1 insertion.
Phương pháp phổ biến hiện nay là Southern blotting nhưng nó lại sử dụng phóng xạ và mất nhiều thời gian nên em sử dụng phương pháp Quantitative real time PCR.
Chỉ có điều khi em tính số lượng copy thì toàn ra những con số không tưởng, kiểu như 7 và 9 copy ý. Có thể là do formulization của em bị sai.
Có anh chị nào đã sử dụng phương pháp này để tính số lượng copy rồi vui lòng chia sẻ cho em kinh nghiệm thực hiện và công thức mà anh chị đã sử dụng được không ạ?

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Control của em là gì? Thiết lập standard curve như thế nào?

 

[Nchicken]

MTP1 và HKT1 được sử dụng như control có 1 copy trong genome của A. thaliana.
Em dựng đường chuẩn bằng cách dilution series 10 lần Total DNA của Transgene A. thaliana để có 5 điểm lập đường chuẩn (từ 3 tới 5 điểm). Ở mỗi nồng độ thì làm 3 mẫu thí nghiệm.
Ct trong khoảng từ 20 tới 35. E > 90%

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

MTP1 và HKT1 được sử dụng như control có 1 copy trong genome của A. thaliana.
Em dựng đường chuẩn bằng cách dilution series 10 lần Total DNA của Transgene A. thaliana để có 5 điểm lập đường chuẩn (từ 3 tới 5 điểm). Ở mỗi nồng độ thì làm 3 mẫu thí nghiệm.
Ct trong khoảng từ 20 tới 35. E > 90%

Cách dựng đường chuẩn thế này có vẻ chưa ổn. Nên làm như sau:

- Kiếm 1 vector chứa inserted gene --> biết được kích thước và nồng độ DNA plasmid --> tính được số copy ứng với 1 nồng độ DNA plasmid.

- Làm dilution series như trên với template là vector này để dựng đường chuẩn.

 

[Nchicken]

Cách dựng đường chuẩn thế này có vẻ chưa ổn. Nên làm như sau:

- Kiếm 1 vector chứa inserted gene --> biết được kích thước và nồng độ DNA plasmid --> tính được số copy ứng với 1 nồng độ DNA plasmid.

- Làm dilution series như trên với template là vector này để dựng đường chuẩn.

Bước 1, Em đã dựng đường chuẩn như trên để biết được efficience của primer. (template là DNA plasmid) -> Mồi OK

Chuyển sang bước thứ 2, quantitative realtime PCR tính copy number

Bước 2, sử dụng dilution series giống như cho standard và template lần này là total DNA. Tiến hành quantitative real time PCR -> So sánh E của primer đối với DNA genomic và DNA plasmid. Nếu chúng tương đương nhau thì đi tính copy number.
Cái vấn đề ở đây là em không biết chính xác như thế nào sẽ được gọi là tương đương. Vì giả sử, giá trị của E thì thay đổi trong khoảng 0,956 là tương đương với 0,90 được không?

 

[Ho Huu Tho]

Mình không hiểu được cụ thể thí nghiệm cũng như công thức của bạn, nhưng mình có ý tưởng thế này không biết có ích cho bạn không:
Bước 1: Dựa và các gen control MTP1 và HKT1 để tính được lượng ADN template cần dùng của các dòng khác nhau, mà số copy của genome trong mẫu ADN này là hoàn toàn bằng nhau.
Bước 2: Tiến hành phản ứng Real-time PCR nhân inserted gene của những mẫu ADN này từ tất cả những dòng mà bạn có. Bạn sẽ thu được các giá trị Ct khác nhau cho mỗi dòng.
Bước 3: Từ phân bố của các giá trị Ct mà bạn thu được, có thể bạn sẽ tìm được câu trả lời cho câu hỏi mà bạn quan tâm.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Bạn tham khảo bài này chưa?
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/btpr.62/pdf

 

[Nchicken]

Bạn tham khảo bài này chưa?
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/btpr.62/pdf

Em cảm ơn anh, em sẽ ngâm cứu nó