Hỏi về xây dựng đường chuẩn non-linear

[Ho Huu Tho]

Để kiểm tra khả năng định lượng của một phương pháp đo, mình tiến hành đo tín hiệu (Y) theo phương pháp đó với các nồng độ khác nhau của chất chuẩn S tham gia phản ứng, mình thu được bảng số liệu như ở tài liệu đính kèm.
Sau khi cho vào phần mềm để xây dựng đường chuẩn theo mô hình "non-linear regression" và với phương trình để "curve fitting" là:

Equation:One site competition
Y=Bottom + (Top-Bottom)/(1+10^(X-LogEC50))

Kết quả thu được từ phần mềm thể hiện như ở trong file đính kèm.
Với những số liệu và kết quả thu được như vậy, các bạn có thể giải đáp giúp mình mấy thắc mắc sau được không:
1. Mình có thể dùng đường chuẩn trong phần kết quả để định lượng nồng độ của chất tham gia phản ứng dựa vào tín hiệu đo Y được không. Nếu được thì:
2. Độ tin cậy của việc áp dụng đường chuẩn đo là bao nhiêu, được tính toán như thế nào?
3. Giới hạn nồng độ của chất phản ứng mà có thể định lượng được chính xác được tính toán như thế nào?
Cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các bạn!

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Không biết bạn Thọ đang làm cái gì.
Mình hay làm ELISA, thấy số liệu khi dùng non-linear curve thì rất fit (log). Nhưng đọc sách thì người ta bảo nên lấy cái vùng có linear thì nhạy hơn. Thấy các lab vẫn dùng linear regression thay vì non-linear. Nếu bạn làm ELISA tôi có thể share một số sách về cái này.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

À, với competitive inhibiting ELISA thì chắc chắn phải xài non-linear. Mình đang nói đến sandwich ELISA.

 

[Chúc Thành]

Để kiểm tra khả năng định lượng của một phương pháp đo, mình tiến hành đo tín hiệu (Y) theo phương pháp đó với các nồng độ khác nhau của chất chuẩn S tham gia phản ứng, mình thu được bảng số liệu như ở tài liệu đính kèm.
Sau khi cho vào phần mềm để xây dựng đường chuẩn theo mô hình "non-linear regression" và với phương trình để "curve fitting" là:

Equation:One site competition
Y=Bottom + (Top-Bottom)/(1+10^(X-LogEC50))

Kết quả thu được từ phần mềm thể hiện như ở trong file đính kèm.
Với những số liệu và kết quả thu được như vậy, các bạn có thể giải đáp giúp mình mấy thắc mắc sau được không:
1. Mình có thể dùng đường chuẩn trong phần kết quả để định lượng nồng độ của chất tham gia phản ứng dựa vào tín hiệu đo Y được không. Nếu được thì:
2. Độ tin cậy của việc áp dụng đường chuẩn đo là bao nhiêu, được tính toán như thế nào?
3. Giới hạn nồng độ của chất phản ứng mà có thể định lượng được chính xác được tính toán như thế nào?
Cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các bạn!

Bạn hỏi về lý thuyết hay sử dụng phần mềm thế?

 

[Ho Huu Tho]

Không biết bạn Thọ đang làm cái gì.
Mình hay làm ELISA, thấy số liệu khi dùng non-linear curve thì rất fit (log). Nhưng đọc sách thì người ta bảo nên lấy cái vùng có linear thì nhạy hơn. Thấy các lab vẫn dùng linear regression thay vì non-linear. Nếu bạn làm ELISA tôi có thể share một số sách về cái này.

Đúng ra là em không biết mình đang làm gì bác Lương ạ, thí nghiệm của em cũng không phải competitive ELISA, nhưng em thấy hình như có sự tương đồng. Sau khi thu được số liệu em chẳng biết phải làm thế nào để xây dựng đường chuẩn cả.
Em mày mò thử các phương trình khác nhau và tình cờ thấy cái phương trình trên của competitive binding curve có vẻ là fit các số liệu trên tốt nhất. Theo như gợi ý của bác Lương thì chắc là để chọn phương trình phù hợp, em cần nắm rõ về bản chất thí nghiệm của mình là gì.
Vậy em xin được nêu cụ thể hơn về thí nghiệm của em, để bác và mọi người góp ý giúp em là em có thể áp dụng được phương trình trên để curve fitting hay không:
- Trộn hai chất chuẩn S1 và S2 với tỉ lệ nồng độ là:
R = S1/S2 = 1, 1/4, 1/16, 1/64, 1/256, 1/1024, 1/4096, 1/16384
Tính X theo công thức: X = log(S1/S2)
- Chất chuẩn S1 tạo ra tín hiệu T1, chất chuẩn S2 tạo ra tín hiệu T2.
- Giá trị của Y được tính theo công thức sau:
Y = T1/(T1+T2)
- Khi R tăng, thì Y tiệm cận đến giá trị là 1; khi R giảm dần về giá trị 0, thì Y tiệm cận đến giá trị 0. Giá trị của Y chỉ phụ thuộc vào tỉ lệ R = S1/S2, mà không phụ thuộc nồng độ của các chất chuẩn.

Bạn hỏi về lý thuyết hay sử dụng phần mềm thế?

Mình hiểu rất ít về lý thuyết và cũng chưa biết sử dụng phần mềm, rất mong nhận được ý kiến góp ý của bạn để mình được học hỏi thêm. Cảm ơn bạn nhiều.

 

[nthanh]

Đúng ra là em không biết mình đang làm gì bác Lương ạ, thí nghiệm của em cũng không phải competitive ELISA, nhưng em thấy hình như có sự tương đồng. Sau khi thu được số liệu em chẳng biết phải làm thế nào để xây dựng đường chuẩn cả.
Em mày mò thử các phương trình khác nhau và tình cờ thấy cái phương trình trên của competitive binding curve có vẻ là fit các số liệu trên tốt nhất. Theo như gợi ý của bác Lương thì chắc là để chọn phương trình phù hợp, em cần nắm rõ về bản chất thí nghiệm của mình là gì.
Vậy em xin được nêu cụ thể hơn về thí nghiệm của em, để bác và mọi người góp ý giúp em là em có thể áp dụng được phương trình trên để curve fitting hay không:
- Trộn hai chất chuẩn S1 và S2 với tỉ lệ nồng độ là:
R = S1/S2 = 1, 1/4, 1/16, 1/64, 1/256, 1/1024, 1/4096, 1/16384
Tính X theo công thức: X = log(S1/S2)
- Chất chuẩn S1 tạo ra tín hiệu T1, chất chuẩn S2 tạo ra tín hiệu T2.
- Giá trị của Y được tính theo công thức sau:
Y = T1/(T1+T2)
- Khi R tăng, thì Y tiệm cận đến giá trị là 1; khi R giảm dần về giá trị 0, thì Y tiệm cận đến giá trị 0. Giá trị của Y chỉ phụ thuộc vào tỉ lệ R = S1/S2, mà không phụ thuộc nồng độ của các chất chuẩn.


Mình hiểu rất ít về lý thuyết và cũng chưa biết sử dụng phần mềm, rất mong nhận được ý kiến góp ý của bạn để mình được học hỏi thêm. Cảm ơn bạn nhiều.

Mình có góp ý thế này, không biết giúp gì được cho bạn không nhưng cũng nói ra.
Nhìn vào kết quả đo của bạn, mình có thắc mắc là không biết cái T1 và T2 có phụ thuộc vào nồng độ của S1 và S2 không? và bạn có thê thu được số liệu riêng rẽ của S1 và S2 (qua T1 và T2) không? hay máy chỉ cho kết quả cuối cùng là tỉ lệ T1/(T1+T2) thôi?

Cái thứ hai là theo mình, cái mà bạn dùng (phương trình, và đường cong hồi quy phi tuyến) là đúng rồi đấy, bạn cứ sử dụng công thức họ cho là tính ra được ngược lại X từ Y mà thôi, cái này chỉ là toán học thôi mà. Nhưng theo mình bạn nên làm thêm các tỉ lệ khác như 1/3, 1/9,... cấp số 3 vì log của chúng rất đẹp, kết hợp với 1/10, 1/100... (tức là bạn làm 2 dãy đó, ta sẽ thu được đường là 1, 1/3, 1/10,1/30.... sau đó kết hợp làm đồ thị thì sẽ thu được đường chuẩn sẽ chính xác hơn là theo cấp số 4 của bạn đấy (mình cũng ít thấy bài báo nào làm cấp số 4 cả vì log không đẹp).

Cái thứ 3 đó là như anh Lương nói, người ta tìm cái chuẩn thì thường dùng đờng tuyến tính, nhưng nếu cái thứ nhất mình hỏi bạn, mà câu trả lời là không thì khó áp dụng, vì để có được đường chuẩn tuyến tính, thì nó cũng chỉ có giới hạn thôi (của cái R ý) và bạn phải làm sao cho cái Y của bạn rơi vào đó thì mới được (ví dụ như pha loãng mẫu, và đo cái Y sao cho rơi vào chuẩn và suy ngược ra).

Mong bạn nói rõ hơn về cái mục đích cũng như cái bạn làm, để mọi người nếu giúp được thì chắc sẽ giúp nhiệt tình thôi.

 

[Chúc Thành]

Mình cũng thử góp vài lời. Về lý thuyết mình nghĩ tạm thời gác lại vì sẽ hơi phức tạp.
Tiện mình vẽ cái đồ thị cho dễ nhìn, trông đường cong rất non-linear. Về công thức, bạn xem thử, nếu mình đổi biến Z = 10^X thì công thức có dạng Hill:

Y = b - (a-b)/(1+cZ) (3 tham số).

Fit một công thức đơn giản thì hay hơn là fit một công thức phức tạp.

Tuy nhiên nhìn vào đồ thị thì có vẻ X của bạn chưa thực hiện logarith, tức là X chính là Z. Mình chỉ nghi ngờ thế thôi, bạn thử kiểm tra xem.

Thêm cái link này có thể có ích:
http://www.graphpad.com/curvefit/logec50_or_ec50_.htm

 

[Ho Huu Tho]

Nhìn vào kết quả đo của bạn, mình có thắc mắc là không biết cái T1 và T2 có phụ thuộc vào nồng độ của S1 và S2 không? và bạn có thê thu được số liệu riêng rẽ của S1 và S2 (qua T1 và T2) không? hay máy chỉ cho kết quả cuối cùng là tỉ lệ T1/(T1+T2) thôi?

Số liệu của S1 và S2 có thể thu được riêng rẽ từ máy đo, giá trị của Y là do mình tự tính từ giá trị của T1 và T2.
Nồng độ của S1 và S2 thay đổi có thể ảnh hưởng đến đến giá trị của T1 và T2 (tương quan thuận), khi nồng độ của S1 và S2 trên một giá trị nhất định thì sự ảnh hưởng này không còn (lúc đó tổng T1+T2 đạt giá trị cực đại)

Mình sẽ tiến hành đo lại với các tỉ lệ như bạn góp ý, cụ thể là: 1, 1/3, 1/10, 1/30, 1/100, 1/300, 1/1000, 1/3000, 1/10.000, 1/30.000, 1/100.000.

 

[nthanh]

Mình có cảm giác là hình như bạn đang làm phức tạp hóa vấn đề của bạn (dù mình không rõ là gì cả), nhưng mình thấy vấn đề của bạn rất hay đấy. Chúc bạn sớm tìm ra câu trả lời.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Đúng ra là em không biết mình đang làm gì bác Lương ạ, thí nghiệm của em cũng không phải competitive ELISA, nhưng em thấy hình như có sự tương đồng. Sau khi thu được số liệu em chẳng biết phải làm thế nào để xây dựng đường chuẩn cả.
Em mày mò thử các phương trình khác nhau và tình cờ thấy cái phương trình trên của competitive binding curve có vẻ là fit các số liệu trên tốt nhất. Theo như gợi ý của bác Lương thì chắc là để chọn phương trình phù hợp, em cần nắm rõ về bản chất thí nghiệm của mình là gì.
Vậy em xin được nêu cụ thể hơn về thí nghiệm của em, để bác và mọi người góp ý giúp em là em có thể áp dụng được phương trình trên để curve fitting hay không:
- Trộn hai chất chuẩn S1 và S2 với tỉ lệ nồng độ là:
R = S1/S2 = 1, 1/4, 1/16, 1/64, 1/256, 1/1024, 1/4096, 1/16384
Tính X theo công thức: X = log(S1/S2)
- Chất chuẩn S1 tạo ra tín hiệu T1, chất chuẩn S2 tạo ra tín hiệu T2.
- Giá trị của Y được tính theo công thức sau:
Y = T1/(T1+T2)
- Khi R tăng, thì Y tiệm cận đến giá trị là 1; khi R giảm dần về giá trị 0, thì Y tiệm cận đến giá trị 0. Giá trị của Y chỉ phụ thuộc vào tỉ lệ R = S1/S2, mà không phụ thuộc nồng độ của các chất chuẩn.


Mình hiểu rất ít về lý thuyết và cũng chưa biết sử dụng phần mềm, rất mong nhận được ý kiến góp ý của bạn để mình được học hỏi thêm. Cảm ơn bạn nhiều.

Tôi ko hiểu lắm bài toán của Thọ nhưng về mặt thực hành thì có vẻ giống với bài toán tôi đang phải làm việc. Nói ra đây xem có giúp Thọ tìm được hướng giải quyết

Bọn Illumina có công nghệ Veracode / GoldenGate Genotyping. Giả sử như bạn có 1 quần thể các cây có kiểu gene AA, Aa, aa. Bạn đặt mồi PCR tương ứng allelic specific với A và a, tương ứng gắn 1 chất huỳnh quang (vd Xanh, đỏ). Bằng việc đo tín hiệu huỳnh quanh (giống T1, T2) thì trả lời bài toán kiểu gene của đối tượng là AA, Aa hay aa. Tất nhiên là công nghệ cho phép multiplex với hàng trăm locus 1 lúc và bài toán có thể phát triển với mức độ phức tạp hơn như với loài polyploid AABB, AABb, AAbb, AaBb; hoặc với CNV.

Để giải bài toán thì trước tiên chúng nó lọc tín hiệu khỏi background bằng normalization, sau đó tính tỷ phần tín hiệu tương tự như bạn tính Y. Nếu Y gần 0 thì chứng tỏ là AA, gần 1 thì là aa còn khoảng giữa thì Aa. Liệu có thể hình dung bài toán của Thọ theo cách đó?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Bạn Thọ nên cung cấp thông tin thêm về thí nghiệm mình đang làm.
Mình cũng đang nghĩ bạn liệu có đang làm phức tạp hóa vấn đề không. Thật ra cách tốt nhất vẫn là tìm một bài báo người ta đã làm rồi và làm lại hệt thế. Thường thì trong thực nghiệm chúng ta không quan tâm nhiều lắm đến việc liệu một mô hình toán học nó có đúng tuyệt đối với cái số liệu mình quan tâm hay không, mà là khả năng lặp lại và so sánh giữa các kết quả (của cùng 1 tác giả và của các tác giả) với nhau thôi.

 

[Chúc Thành]

Để kiểm tra khả năng định lượng của một phương pháp đo, mình tiến hành đo tín hiệu (Y) theo phương pháp đó với các nồng độ khác nhau của chất chuẩn S tham gia phản ứng, mình thu được bảng số liệu như ở tài liệu đính kèm.
Sau khi cho vào phần mềm để xây dựng đường chuẩn theo mô hình "non-linear regression" và với phương trình để "curve fitting" là:

Equation:One site competition
Y=Bottom + (Top-Bottom)/(1+10^(X-LogEC50))

Kết quả thu được từ phần mềm thể hiện như ở trong file đính kèm.
Với những số liệu và kết quả thu được như vậy, các bạn có thể giải đáp giúp mình mấy thắc mắc sau được không:
1. Mình có thể dùng đường chuẩn trong phần kết quả để định lượng nồng độ của chất tham gia phản ứng dựa vào tín hiệu đo Y được không. Nếu được thì:
2. Độ tin cậy của việc áp dụng đường chuẩn đo là bao nhiêu, được tính toán như thế nào?
3. Giới hạn nồng độ của chất phản ứng mà có thể định lượng được chính xác được tính toán như thế nào?
Cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các bạn!

Mục 2, topic này chắc mọi người quên rồi nhưng hôm nay ngồi rảnh mình mới nghĩ phương pháp đơn giản nhất chắc là dùng Monte-Carlo (có thể viết công thức tích phân Bayesian nhưng trừ hồi qui tuyến tính mình không nghĩ là có thể tính được. Tính toán sẽ phức tạp với các tích phân số.)

Giả sử thực hiện hồi qui y theo x. Giờ ta muốn thực hiện hồi qui ngược y_0 suy ra x_0, đánh giá độ tin cậy:

(i) Tính x_0 từ y_0 bằng cách nghịch đảo hàm hồi qui: y(x) -> x.
(ii) Giờ giả sử x_0 là giá trị đúng thì y_0 sẽ là giá trị kỳ vọng đúng. Lấy số ngẫu nhiên phân bố chuẩn quanh y_0 với standard deviation ước lượng ở trên (N = 1000 số chẳng hạn), {y_1, y_2, ... y_N}. Từ N số này tính {x_1,x_2...,x_N} tương ứng. Từ đó ta có một phân bố của {x_i} xung quanh x_0. Lấy khoảng chứa 95% số điểm về hai phía làm độ tin cậy.

Chắc phần mềm sẽ tích hợp sẵn chương trình con để tính và phương pháp tính chắc người dùng cũng không cần biết kỹ lắm đâu :-D