Lê Tiến Dũng
Senior Member
Enzyme purification!
Chào các bạn,
Hôm nay tình cờ biết được có trang web này mình vào ngay, quả thật là trước đó tưởng chưa có trang nào như thế này tôi đang định làm một trang. Nay thấy có rồi chắc ý định kia của tôi sẽ bỏ dở thôi. Mục đích là tạo ra sân chơi cho người làm về sinh học đồng để kết nối chúng ta lại với nhau, hy vọng khi đủ mạnh có thể làm được nhiều việc hơn.
Về chủ đề tinh sạch protein (enzyme) mình bắt đầu làm quen từ khi còn là sinh viên năm thứ 2, còn nhớ một chút nên chia sẻ với các bạn.
Trước khi bắt đầu tinh sạch protein có họat tính enzyme, chúng ta luôn phải nghĩ ở trong đầu là nó rất dễ dàng mất hoạt tính (hầu hết nhưng không phải là tất cả), vì vậy mọi thao tác cần phải được thực hiện trong nhiệt độ lạnh (thường là 4oC), càng ít các bứớc càng tốt.
1- Đối với tinh sạch enzyme là protein tái tổ hợp thì đơn giản hơn, vì khi thiết kế vector biểu hiện thường người ta có nối với 1 cái đuôi có ái lực với một chất nào đó, và vì thế sau khi tách chiết từ tế bào E. coli, bạn chỉ cần 1 hoặc 2 bước sắc ký ái lực là có thể thu được enzyme hoàn toàn tinh sạch. (his tag, GST tag, etc).
2- Có lẽ phức tạp hơn vẫn là tinh sạch protein có nguồn gốc tự nhiên, theo mình thì có thể có các bước sau, có thể phối hợp các bước hoặc không:
- Kết tủa sơ bộ protein bằng acetone lạnh hoặc sulfat amôn lạnh 70%, sau đó thì ly tâm lấy kết tủa và hòa tan lại trong dịch đệm, với acetone bạn có thể lắng rồi đổ đi và chờ cho acetone bay hơi.
- Nếu protein của bạn đã biết MW thì đơn giản nhất vẫn là dùng sắc ký lọc gel, sử dụng sephadex hoặc suphadex. Bạn xác định hoạt tính enzyme của các phân đoạn xuống cột để xác định đỉnh protein nào là đỉnh có enzyme của bạn. Sau đó thu các phân đoạn rồi cô đặc, để kiểm tra độ sạch bạn có thể dùng SDS-PAGE (điện di).
- Nếu thấy chưa sạch bạnbạn có thể dùng phương pháp sắc ký trao đổi ion. Kể cả khi bạn chưa biết điểm đẳng điện cũng không lo, bạn kiểm tra hoạt tính enzyme của cả phần không bám cột và phần bám vào cột để từ đó thu lại phần có chứa enzyme của bạn.
- Nếu vẫn thấy chưa sạch bạn có thể sử dụng tiếp phương pháp sắc ký dựa trên tính ái nước và kỵ nước của enzyme đó, đặc tính này của các protein khác nhau cũng khác nhau, có lại bám dễ dàng vào chất mang kỵ nước, có loại thì không. Loại cột này thường đi kèm với hệ thống sắc ký nhanh FPLC, còn các loại cột trên bạn có thể làm thủ công được (kô cần hệ thống FPLC).
- Một số enzyme có khả năng bám rất đặc hiệu với chất ức chế hoặc cơ chất của nó, ví dụ như trypsin hay trypsin-like protease bám tốt vào chất ức chế trypsin, bạn có thể mua hoặc chuẩn bị cột có chất mang gắn với chất này, sau khi cho dung dịch protein đi qua, chỉ có enzyme bạn cần bám lại, sau khi rửa cột bạn có thể cho xuống cột bằng đệm có nồng độ muối cao hoặc có chứa chính chất gắn trên chất mang của cột.
Ngoài ra, trước khi bạn làm thí nghiệm tinh sạch bạn cũng cần phải trả lời câu hỏi là "bạn tinh sạch dạng analytical hay preparative?" nếu là preparative tức là bạn sẽ phải thu mẫu sau khi tinh sạch (một lượng đủ lớn) để làm việc khác ví dụ như để xác định tính chất enzyme hay thậm chí để làm thuốc, từ đó bạn sẽ biết lựa chọn kỹ thuật phù hợp.
Tùy từng loại enzyme và họat tính của nó bạn cũng có thể có thêm nhiều phương pháp khác. Chẳng hạn như phương pháp điện di preparative PAGE. Bạn chạy 2 bản native PAGE sau đó một bản bạn nhuộm họat tính enzyme hoặc protein để xác định vị trí band của bạn sau đó trên bản còn lại bạn cắt và elute protein đó xuống, disadvatages: lượng enzyme thu được rất ít.
Bạn nào biết về các phương pháp khác thì giới thiệu nhé, thân mếu!
Chào các bạn,
Hôm nay tình cờ biết được có trang web này mình vào ngay, quả thật là trước đó tưởng chưa có trang nào như thế này tôi đang định làm một trang. Nay thấy có rồi chắc ý định kia của tôi sẽ bỏ dở thôi. Mục đích là tạo ra sân chơi cho người làm về sinh học đồng để kết nối chúng ta lại với nhau, hy vọng khi đủ mạnh có thể làm được nhiều việc hơn.
Về chủ đề tinh sạch protein (enzyme) mình bắt đầu làm quen từ khi còn là sinh viên năm thứ 2, còn nhớ một chút nên chia sẻ với các bạn.
Trước khi bắt đầu tinh sạch protein có họat tính enzyme, chúng ta luôn phải nghĩ ở trong đầu là nó rất dễ dàng mất hoạt tính (hầu hết nhưng không phải là tất cả), vì vậy mọi thao tác cần phải được thực hiện trong nhiệt độ lạnh (thường là 4oC), càng ít các bứớc càng tốt.
1- Đối với tinh sạch enzyme là protein tái tổ hợp thì đơn giản hơn, vì khi thiết kế vector biểu hiện thường người ta có nối với 1 cái đuôi có ái lực với một chất nào đó, và vì thế sau khi tách chiết từ tế bào E. coli, bạn chỉ cần 1 hoặc 2 bước sắc ký ái lực là có thể thu được enzyme hoàn toàn tinh sạch. (his tag, GST tag, etc).
2- Có lẽ phức tạp hơn vẫn là tinh sạch protein có nguồn gốc tự nhiên, theo mình thì có thể có các bước sau, có thể phối hợp các bước hoặc không:
- Kết tủa sơ bộ protein bằng acetone lạnh hoặc sulfat amôn lạnh 70%, sau đó thì ly tâm lấy kết tủa và hòa tan lại trong dịch đệm, với acetone bạn có thể lắng rồi đổ đi và chờ cho acetone bay hơi.
- Nếu protein của bạn đã biết MW thì đơn giản nhất vẫn là dùng sắc ký lọc gel, sử dụng sephadex hoặc suphadex. Bạn xác định hoạt tính enzyme của các phân đoạn xuống cột để xác định đỉnh protein nào là đỉnh có enzyme của bạn. Sau đó thu các phân đoạn rồi cô đặc, để kiểm tra độ sạch bạn có thể dùng SDS-PAGE (điện di).
- Nếu thấy chưa sạch bạnbạn có thể dùng phương pháp sắc ký trao đổi ion. Kể cả khi bạn chưa biết điểm đẳng điện cũng không lo, bạn kiểm tra hoạt tính enzyme của cả phần không bám cột và phần bám vào cột để từ đó thu lại phần có chứa enzyme của bạn.
- Nếu vẫn thấy chưa sạch bạn có thể sử dụng tiếp phương pháp sắc ký dựa trên tính ái nước và kỵ nước của enzyme đó, đặc tính này của các protein khác nhau cũng khác nhau, có lại bám dễ dàng vào chất mang kỵ nước, có loại thì không. Loại cột này thường đi kèm với hệ thống sắc ký nhanh FPLC, còn các loại cột trên bạn có thể làm thủ công được (kô cần hệ thống FPLC).
- Một số enzyme có khả năng bám rất đặc hiệu với chất ức chế hoặc cơ chất của nó, ví dụ như trypsin hay trypsin-like protease bám tốt vào chất ức chế trypsin, bạn có thể mua hoặc chuẩn bị cột có chất mang gắn với chất này, sau khi cho dung dịch protein đi qua, chỉ có enzyme bạn cần bám lại, sau khi rửa cột bạn có thể cho xuống cột bằng đệm có nồng độ muối cao hoặc có chứa chính chất gắn trên chất mang của cột.
Ngoài ra, trước khi bạn làm thí nghiệm tinh sạch bạn cũng cần phải trả lời câu hỏi là "bạn tinh sạch dạng analytical hay preparative?" nếu là preparative tức là bạn sẽ phải thu mẫu sau khi tinh sạch (một lượng đủ lớn) để làm việc khác ví dụ như để xác định tính chất enzyme hay thậm chí để làm thuốc, từ đó bạn sẽ biết lựa chọn kỹ thuật phù hợp.
Tùy từng loại enzyme và họat tính của nó bạn cũng có thể có thêm nhiều phương pháp khác. Chẳng hạn như phương pháp điện di preparative PAGE. Bạn chạy 2 bản native PAGE sau đó một bản bạn nhuộm họat tính enzyme hoặc protein để xác định vị trí band của bạn sau đó trên bản còn lại bạn cắt và elute protein đó xuống, disadvatages: lượng enzyme thu được rất ít.
Bạn nào biết về các phương pháp khác thì giới thiệu nhé, thân mếu!
