Thiết kế vector biểu hiện IL6 trong E-coli
- Thread starter MaThan88
- Start date
. Ai có tài liệu về thiết kế vector, thiết kế mồi, thiết kế enzym giới hạn cắt, biểu hiện gen và tinh sạch protein thì cho em xin với nha! Cảm ơn cả nhà ạ!! 
Bạn cứ làm từng bước đi, mọi người sẽ chia sẻ kinh nghiệm từng bước với bạn.
Ví dụ, đầu tiên sẽ là:
+ chọn vector biểu hiện
+ chọn chủng biểu hiện
Ví dụ, đầu tiên sẽ là:
+ chọn vector biểu hiện
+ chọn chủng biểu hiện
Về nguyên tắc thì bạn cứ chọn hai trong số các enzyme ở vị trí MCS thôi. Và khi thiết kế đoạn gene thì đặt mồi có 2 enzyme này ở hai đầu 5' của mồi. Phải nhớ kiểm tra xem khi clone vào có đúng khung đọc không.
Cái vector này có vẻ bất tiện nhỉ? Có tận 2 his-tag, lại còn GST tag.
Cái vector này có vẻ bất tiện nhỉ? Có tận 2 his-tag, lại còn GST tag.
Cảm ơn anh Lương đã giúp đỡ, về mặt phương pháp và cách làm em đã nắm được quy trình từ khi có vector tái tổ hợp đến biến nạp, biểu hiện... Nhưng làm sao để có được vector tái tổ hợp có gắn đoạn gen mình mong muốn đó thì em hoàn toàn mù tịt ạ
Em vẫn chưa hiểu hết nguyên tắc của việc làm sao để tách đoạn gen đó từ DNA tổng số dựa trên các đoạn bảo thủ và đặc biệt là làm sao để có thể chọn được enzyme cắt thích hợp cho cả gene of interest và vector, ligation vào như thế nào. Tìm tài liệu ko có mấy, Giáo sư thì bận quá nên mới mon men lên đây nhờ mọi người. Ai có thời gian rảnh chỉ em với nha. SPECIALLY THANK!
Em vẫn chưa hiểu hết nguyên tắc của việc làm sao để tách đoạn gen đó từ DNA tổng số dựa trên các đoạn bảo thủ và đặc biệt là làm sao để có thể chọn được enzyme cắt thích hợp cho cả gene of interest và vector, ligation vào như thế nào. Tìm tài liệu ko có mấy, Giáo sư thì bận quá nên mới mon men lên đây nhờ mọi người. Ai có thời gian rảnh chỉ em với nha. SPECIALLY THANK!
Tôi thường làm tay thôi bạn ạ.
Ví dụ bạn có cái map và sequence quanh vùng MCS rồi nhé. Thường thì đa số vector đã có promoter, SD sequence (vị trí gắn Ribosome), mã mở đầu và mã kết thúc. Ngoài ra nó có thể có thêm 1 số sequence như 6His, GST, intein...v.v nhằm hỗ trợ quá trình tinh sạch.
Bạn copy toàn bộ cái sequence đó vào file word.
Sau đó bạn copy cái trình tự của bạn (chỉ có khung đọc không có mã mở đầu kết thúc) và chèn vào vị trí MCS, ở bất kỳ vị trí nào nằm giữa 2 enzyme cắt giới hạn bạn chọn. Kiểm tra xem dịch mã có ra đúng protein bạn muốn hay không. Nếu đúng rồi thì thiết kế mồi bằng cách copy khoảng 18-25 Nu nằm ở đoạn đầu và đoạn cuối của gene của bạn, kèm theo 6 cái Nu của vị trí enzyme nằm ngay trước và sau cái gene đó.
Sau đó bạn copy toàn bộ trình tự này vào một text file lưu trong máy. Khi construct của bạn đã hoàn thành bạn có thể align sequence lý thuyết với kết quả giải trình tự sẽ rất tiện.
Để vẽ cho đẹp đưa vào báo thì bạn có thể dùng Vector NTI để thao tác cắt và nối.
Để có được gene của bạn từ DNA tổng số (genomic DNA), bạn có thể dùng mồi đặc hiệu, mồi thoái hóa. Hoặc dùng thư viện cDNA, hoặc RT-PCR từ mRNA...v.v. Trường hợp dùng mồi thoái hóa, tôi đã sử dụng rất thành công chương trình iCODEHOPE để nhân vài gene quan tâm. Ưu điểm của iCODEHOPE là chỉ có khoảng 12 Nu ở đầu 3' là thoái hóa, còn tất cả ở đầu 5' là đặc hiệu, giúp giảm độ thoái hóa của mồi và làm tăng tính đặc hiệu của pứ.
Ví dụ bạn có cái map và sequence quanh vùng MCS rồi nhé. Thường thì đa số vector đã có promoter, SD sequence (vị trí gắn Ribosome), mã mở đầu và mã kết thúc. Ngoài ra nó có thể có thêm 1 số sequence như 6His, GST, intein...v.v nhằm hỗ trợ quá trình tinh sạch.
Bạn copy toàn bộ cái sequence đó vào file word.
Sau đó bạn copy cái trình tự của bạn (chỉ có khung đọc không có mã mở đầu kết thúc) và chèn vào vị trí MCS, ở bất kỳ vị trí nào nằm giữa 2 enzyme cắt giới hạn bạn chọn. Kiểm tra xem dịch mã có ra đúng protein bạn muốn hay không. Nếu đúng rồi thì thiết kế mồi bằng cách copy khoảng 18-25 Nu nằm ở đoạn đầu và đoạn cuối của gene của bạn, kèm theo 6 cái Nu của vị trí enzyme nằm ngay trước và sau cái gene đó.
Sau đó bạn copy toàn bộ trình tự này vào một text file lưu trong máy. Khi construct của bạn đã hoàn thành bạn có thể align sequence lý thuyết với kết quả giải trình tự sẽ rất tiện.
Để vẽ cho đẹp đưa vào báo thì bạn có thể dùng Vector NTI để thao tác cắt và nối.
Để có được gene của bạn từ DNA tổng số (genomic DNA), bạn có thể dùng mồi đặc hiệu, mồi thoái hóa. Hoặc dùng thư viện cDNA, hoặc RT-PCR từ mRNA...v.v. Trường hợp dùng mồi thoái hóa, tôi đã sử dụng rất thành công chương trình iCODEHOPE để nhân vài gene quan tâm. Ưu điểm của iCODEHOPE là chỉ có khoảng 12 Nu ở đầu 3' là thoái hóa, còn tất cả ở đầu 5' là đặc hiệu, giúp giảm độ thoái hóa của mồi và làm tăng tính đặc hiệu của pứ.
