What's new

Kinh nghiệm thiết kế vector khi kích thước đoạn DNA insert lớn

Miss Le

Member
Mình sắp phải thiết kế một vector biểu hiện trong thực vật (kích thước vector là 9,5 Kb) nhưng kích thước đoạn DNA cần insert vào khá lớn (> 3 Kb) nên có thể quá trình ligation sẽ gặp khó khăn. Anh chị em nào đã từng giải quyết vấn đề tương tự như vậy xin chia sẻ kinh nghiệm.
Chân thành cảm ơn mọi người.
 
Bạn mình xài binary vector kích thước 11 kpb và insert tầm khoảng 2.5. Khó nối nhưng cứ kiên trì rồi sẽ ra (có thể thử biến đổi các tỉ lệ vector:insert). Bạn nhớ xử lý Phosphatase vector trước nếu là blunt end ligation. Khi biến nạp thì ly tâm tế bào xuống rồi hút bớt LB ra còn lại tầm khoảng 100 ul rồi hãy trải lên dĩa. Một ngày đẹp trời 1 colony mọc lên và chính là nó đó :D
 

Biologist

Member
Mình sắp phải thiết kế một vector biểu hiện trong thực vật (kích thước vector là 9,5 Kb) nhưng kích thước đoạn DNA cần insert vào khá lớn (> 3 Kb) nên có thể quá trình ligation sẽ gặp khó khăn. Anh chị em nào đã từng giải quyết vấn đề tương tự như vậy xin chia sẻ kinh nghiệm.
Chân thành cảm ơn mọi người.

Miss Le: Khi làm ligation, Bạn nên cố gắng dùng nồng độ insert cao gấp 5-10 lần so với vector. Sai lầm mà nhiều "junior" kỹ thuật viên thường mắc phải khi làm ligation là dùng quá nhiều DNA.

Bạn đang dùng binary hay co-integrate vector? Tôi thường clone ~3kb - 5kb inserts vào vectors có kích thước >12kb mà không gặp trở ngại gì đáng kể.

Chúc thành công,
 

Miss Le

Member
Miss Le: Khi làm ligation, Bạn nên cố gắng dùng nồng độ insert cao gấp 5-10 lần so với vector. Sai lầm mà nhiều "junior" kỹ thuật viên thường mắc phải khi làm ligation là dùng quá nhiều DNA.

Bạn đang dùng binary hay co-integrate vector? Tôi thường clone ~3kb - 5kb inserts vào vectors có kích thước >12kb mà không gặp trở ngại gì đáng kể.

Chúc thành công,

Cảm ơn bạn. Thiết kế của mình dùng binary vector. Nhờ những kinh nghiệm quí báu mà các bạn chia sẻ và cũng có phần may mắn, tuần vừa rồi mình đã hoàn thành việc thiết kế rồi, bây giờ đang chuẩn bị biến nạp vào Agrobacterium và chuyển gen vào cây.
 

Miss Le

Member
Bạn mình xài binary vector kích thước 11 kpb và insert tầm khoảng 2.5. Khó nối nhưng cứ kiên trì rồi sẽ ra (có thể thử biến đổi các tỉ lệ vector:insert). Bạn nhớ xử lý Phosphatase vector trước nếu là blunt end ligation. Khi biến nạp thì ly tâm tế bào xuống rồi hút bớt LB ra còn lại tầm khoảng 100 ul rồi hãy trải lên dĩa. Một ngày đẹp trời 1 colony mọc lên và chính là nó đó :D

Cảm ơn bạn. Trước giờ trên lab mình cũng có một số người trước khi trải đĩa cũng ly tâm để concentrate tế bào nhưng mình chưa thử bao giờ vì trải bình thường khuẩn lạc cũng nhiều lắm rồi. Nhưng thật sự trong trường hợp hiệu suất ligation thấp như thế này, chiến thuật đó theo mình thử thì khá hiệu quả.
(y)
 
Mình hoàn toàn chưa có kinh nghiệm gì với cloning và mấy hôm vừa rồi đang cắm đầu cắm cổ dùng kit CloneJet (K1231) của Fermentas (có sắn trong lab mà) với đoạn insert kích thước khoảng 4kb, làm đã 3 lần rồi mà chưa được (trong khi 1 bạn cùng lab làm với đoạn insert tầm 1.1kb thì đã ok rồi). Tỉ lệ insert:vector sử dụng là 3:1 Vector pJet1.2/blunt này thấy đưa thông tin kích thước là 2974bp. Có phải mình đang đâm đầu vào đá không?

Mình thấy nhà sản xuất nói trong manual là có thể nối đoạn insert kích thước từ 6pb đến 10kb nên lúc đầu cũng không băn khoăn gì. Nghe ra cái thì hình như mình đang quá ngây thơ.

Các tiền bối có thể giúp cho em một lời khuyên không ạ? Tks.
 

Cao Xuân Hiếu

Administrator
Để clon tầm 1.1kb thì là chuyện bt rồi. 4kb ko phải là quá khó (tuy thuộc nó gây độc tế bào ntn thì ko phán trc được). Vấn đề của bạn có lẽ là ở chỗ chưa có kinh nghiệm cloning mấy. Theo mình nghĩ điều này có thể giải quyết = cách sử dụng các thí nghiệm control song song với thí nghiệm mẫu (có thể xin đoạn 1.1kb của bạn cùng lab để làm control). Khi nào bạn làm song song mà có đc clon đoạn 1.1kb mà k được 4kb thì post lại xem bạn gặp kết quả ntn. Từ đó chắc bắt bệnh chuẩn hơn.
 
Cảm ơn anh Hiếu, đúng là em cũng không có thông tin gì về chuyện đoạn insert của mình có trình tự nào độc với tế bào không.

Ý em khi đưa ra cậu chuyện 1.1kb của bạn cùng lab là vì em và bạn ý đã làm trong cùng 1 mẻ (mẻ hỏng thứ 3 của em). Còn ở mẻ hỏng thứ nhất em có làm song song cùng với 1 đoạn insert khác kích thước 2.5kb thì cũng thành công rồi. Do đó có lẽ vấn đề không phải là ở chỗ thao tác.
Rồi khi nghe các bạn thảo luận về kích thước của vector và insert em bắt đầu lo lắng về chuyện kích thước của insert. Theo anh (và các anh/chị/em khác nữa) thì lo lắng này có đáng không ạ?

Một điểm rất huyền bí ở đây là trong lần vừa rồi (Hỏng 3 của em, hic... sao cái chữ hỏng nó cứ ám ảnh thế này hả trời), ligation control không thành công còn transformation control lại có số lượng rất ít mà đoạn insert của bạn ý vẫn thành công (dù số lượng khuẩn lạc cũng chỉ lác đác thôi, ít nhất thì cũng đúng và đủ dùng).
Em có hơi lo lắng về E.coli đang sử dụng (của Promega) không tốt lắm nên đã order 1 loại có transformation efficiency cao hơn và hi vọng có thể lặp lại thí nghiệm trong 1 vài ngày tới. Nếu anh chị em có lời khuyên nào trước khi em có thể tiến hành để "nâng cao hi vọng" thì tốt quá :)
 
Kinh nghiệm của cloning là "try and try again". Nhiều trường hợp clone khó phải mất cả vài tuần đến...vài tháng (có thật chứ không phải dọa đâu ạ).
Tất nhiên là mỗi lần clone bạn nên làm như bạn Hiếu bảo để rút kinh nghiệm cho lần làm tiếp theo.
Nếu mê tín có thể thắp hương khấn ông E.coli :mrgreen:
Nên tự làm competent cells vì khi bạn chọn được mẻ tế bào khả biến tốt nhất thì khi đó bạn mới có thể loại suy được những yếu tố ligation.

Thường khi sau khi ligation ON thì mình lấy 2-5 ul ligation mix/10 ul để đem đi biến nạp. Lượng còn lại tống vào tủ lạnh 4 độ. Nếu pứ thất bại sẽ lấy lượng còn lại để biến nạp tiếp vào hôm sau.

Còn nhớ 1 lần làm ligation một đoạn khá ngắn mà 2 lần đều không ra khuẩn lạc. Xem lại cái ligase thì hóa ra là loại 1/300 dilution. Không hiểu tại sao lại có loại này lạc vào lab. Sau đó hỏi bọn lab và vứt đi.
 
Giờ bảo em tự làm gì cũng khó bác Lương ạ :( Đợi xem lần này cell mới về + những lời khuyên đã nhận có cho colonies không, nếu không em sẽ trở lại với tùy chọn "tự làm competent cells"

Em thích lời khuyên cụ thể Kinh nghiệm của cloning là "try and try again" nhưng sợ khủng khiếp đoạn sau Nhiều trường hợp clone khó phải mất cả vài tuần đến...vài tháng (có thật chứ không phải dọa đâu ạ)
Và thích cả câu thứ ba trong chữ ký nữa, highly applicable

Đặc biệt thích phần "thắp hương khấn ông E.coli, mỗi tội không biết mua hương ở đâu :D
 
Cảm ơn các bác đã chỉ bảo, hôm nay em đã có kết quả cloning với competent cells mới rồi. Có band đúng kích thước 4kb nhưng không biết nảy nòi ở đâu ra thêm band tầm 500bp và 1kb. Để em xem sequence xem có đúng không nữa... phew
Dù sao tới bước này cũng cảm ơn các bác nhiều ạ! Good news before weekend :)

Trở lại chuyện cloning, em đã làm lại ligation mix với tỉ lệ 3:1 insert:vector theo mole (lần trước làm theo weight, sai cả manual). Em có giữ lại ligation mix của lần trước nên lần này thực hiện transformation cho cả hai mix. Kết quả là được 1 lượng ít khuẩn lạc từ ligation mix cũ và nhiều hơn nhiều lần khuẩn lạc từ ligation mix làm lại. Như vậy có vẻ là những lần trước em có cả vấn đề với competent cells và ligation mix. Dù sao thì kết luận vector cloning không có lỗi gì.

Rất mong được các anh chị và các bạn tiền bối đánh giá, em nhận xét thế có ổn không ạ?
 
Sao mọi người hay cả manual thường hay recommend dùng tỉ lệ insert : vector (mole) là x:1 (với x >1). Hình như 1:1 là đẹp nhất?
 

Facebook

Top