What's new

Gene cloning Prion (PrP) from Korean bovine

GENE CLONING PRION (PrP) FROM KOREAN BOVINE

Đặng Quốc Bảo

A prion — short for proteinaceous infectious particle — is a unique type of infectious agent, as it is made only of protein. Prion diseases, also called  Transmissible Spongiform Encephalopathies(TSE), are  neurodengenerative diseases that affect ether animal or human.Some of diseases is decribled in Table 1.  (Prusiner,1998).
In mammals, a normal prion protein (PrPc) is a normal cellular protein that is expressed in the neurons and glia of the brain and spinal cord, as well as in several peripheral tissues and leukocyte. PrPc also has some charecteristic still unknown.( Kang et al 2004). PrP play a central role in the transmission and pathogenesis of prion disease, but the abnormal isoform is an essential component of the prion particle (Prusiner, 1991).  Although PrPc and PrPsc have the same amino acid sequence, they are different in structural conformation. PrPc can be changed into the disease-causing isoform(PrPsc)  so the key to understanding the pathogenesis of this disease is the conformatinal conversion from PrPc( cell surface glycoprotein)  to pathogenesis isoform PrPsc.  PrPc is rich in α- helical (about 40%) content and has little β-sheet structure, whereas PrPsc has less α- helical (about 30%) content and high β-sheet(about 45%) structure(Pan et al. 1993; Pergami, P., Jaffe, H. & Safar, J. 1996). This difference in secondary structure makes the sensitivity to proteinase K (PK), and solubility are different( Corsaro et al,2002)
Bovine spongiform encephalopathy (BSE) is one of the most notable prion diseases. After infecting into bovine, the average time for BSE incubating is about 5 years. Therefore the disaster was not recognized until BSE infected more than 160,000 cattle, primarily dairy cows over 1980s (Anderson et al. 1996). Some study showed that BSE is a massive common-source epidemic caused by meat and bone meal(MBM) fed primarily to dairy cows(Nathanson et al. 1997; Wilesmith et al. 1991). The MBM was prepared from the offal of sheep, cattle, pigs, and chickens as a high-protein nutritional supplement.
BSE is not only potential risk on bovine but also on human. Believed related to BSE,  variant Creutzfeldt-Jakob disease (vCJD) was first reported in March 1996 in the UK.  In contrast to the classical forms of CJD, vCJD has affected younger patients (average age 29 years, as opposed to 65 years), has a relatively longer duration of illness (median of 14 months as opposed to 4.5 months) and is strongly linked to exposure, probably through food, to BSE. Similarities observed between the strain of the agent responsible for vCJD and those of BSE and closely related agents transmitted naturally and experimentally to different animal species, are consistent with the hypothesis discussed during two 1996 WHO consultations: that the cluster of vCJD cases is due to the same agent that caused BSE in cattle.  (WHO, 2002)
After the first outbreak in England in 1986, BSE spread throughout only Europe up to 2000. However, since 2001, it is spreading to counntries such as Japan (2001), Israel (2002), Canada (2003), and the United States (case found in Canadian cattle in 2003. OIE classifies the US as a BSE- free country). There were a total of 189,000 outbreaks in 23 countries (excluding the US) up to February 2005. Until now Korea is free from BSE (Tae-Yung Kim et. al,2005), but the BSE is high  risk damage society. The study on BSE is absolutelly essential.

In this study under the instruction of professor Kwon Moosik and associate professor Nguyen Ngoc Tuan, we are working on full gene of prion . As the first step of prion research, we are cloned full gene of prion encoding bovine prion protein from Korean bovine.
PrP gene is cloned from cDNA of Korean bovine genome by PCR following 2 primers forward and reverses primer (Figure 2). Cloned gene is transmitted in to pGEMT easy vector. Recombination vector is transformed into E.coli. Recombinant vector is sequenced.
 After successful cloning, we change FR to expression vector. Protein that collected will be studied.
 
ảo ?
Bài gửiGửi ngày: 09/05/2006 ? ?Tiêu đề: GENE CLONING PRION (PrP) FROM KOREAN BOVINE
GENE CLONING PRION (PrP) FROM KOREAN BOVINE

Đặng Quốc Bảo

A prion — short for proteinaceous infectious particle — is a unique type of infectious agent, as it is made only of protein. Prion diseases, also called ?Transmissible Spongiform Encephalopathies(TSE), are ?neurodengenerative diseases that affect ether animal or human.Some of diseases is decribled in Table 1. ?(Prusiner,1998).
In mammals, a normal prion protein (PrPc) is a normal cellular protein that is expressed in the neurons and glia of the brain and spinal cord, as well as in several peripheral tissues and leukocyte. PrPc also has some charecteristic still unknown.( Kang et al 2004). PrP play a central role in the transmission and pathogenesis of prion disease, but the abnormal isoform is an essential component of the prion particle (Prusiner, 1991). ?Although PrPc and PrPsc have the same amino acid sequence, they are different in structural conformation. PrPc can be changed into the disease-causing isoform(PrPsc) ?so the key to understanding the pathogenesis of this disease is the conformatinal conversion from PrPc( cell surface glycoprotein) ?to pathogenesis isoform PrPsc. ?PrPc is rich in α- helical (about 40%) content and has little β-sheet structure, whereas PrPsc has less α- helical (about 30%) content and high β-sheet(about 45%) structure(Pan et al. 1993; Pergami, P., Jaffe, H. & Safar, J. 1996). This difference in secondary structure makes the sensitivity to proteinase K (PK), and solubility are different( Corsaro et al,2002)
Bovine spongiform encephalopathy (BSE) is one of the most notable prion diseases. After infecting into bovine, the average time for BSE incubating is about 5 years. Therefore the disaster was not recognized until BSE infected more than 160,000 cattle, primarily dairy cows over 1980s (Anderson et al. 1996). Some study showed that BSE is a massive common-source epidemic caused by meat and bone meal(MBM) fed primarily to dairy cows(Nathanson et al. 1997; Wilesmith et al. 1991). The MBM was prepared from the offal of sheep, cattle, pigs, and chickens as a high-protein nutritional supplement.
BSE is not only potential risk on bovine but also on human. Believed related to BSE, ?variant Creutzfeldt-Jakob disease (vCJD) was first reported in March 1996 in the UK. ?In contrast to the classical forms of CJD, vCJD has affected younger patients (average age 29 years, as opposed to 65 years), has a relatively longer duration of illness (median of 14 months as opposed to 4.5 months) and is strongly linked to exposure, probably through food, to BSE. Similarities observed between the strain of the agent responsible for vCJD and those of BSE and closely related agents transmitted naturally and experimentally to different animal species, are consistent with the hypothesis discussed during two 1996 WHO consultations: that the cluster of vCJD cases is due to the same agent that caused BSE in cattle. ?(WHO, 2002)
After the first outbreak in England in 1986, BSE spread throughout only Europe up to 2000. However, since 2001, it is spreading to counntries such as Japan (2001), Israel (2002), Canada (2003), and the United States (case found in Canadian cattle in 2003. OIE classifies the US as a BSE- free country). There were a total of 189,000 outbreaks in 23 countries (excluding the US) up to February 2005. Until now Korea is free from BSE (Tae-Yung Kim et. al,2005), but since BSE has a high potential of social damage, thus the study on BSE is obviously imparative.

In this study under the supervision of professor Kwon Moosik and associate professor Nguyen Ngoc Tuan, we are working on full gene of prion . As the first step of prion study, we are going to clone full gene of prion encoding bovine prion protein from Korean bovine. PrP gene is cloned from cDNA of Korean bovine genome by PCR with a pair of forward & backward primers (Figure 2). Cloned gene is then transmitted in to pGEMT easy vector. Subsequently ?recombination vector is transformed into E.coli and after that recombinant vector is sequenced.
After successful cloning, we change FR to expression vector. Protein product will then be studied.

Tại sao phải sequence nó nhỉ? Lai kiểm tra không được à?
 
phần introducttion thì khỏi nói là có sự copy and paste ở đâu đó, nên miễn bàn, hiếm khi đọc kỹ. Riêng phần working-plan thì quá sơ lược, ít ra nên triển khai bằng hoặc dài hơn đoạn introduction. Lỗi câu cú chữ nghĩa cho đoạn này không ít

In this study under the supervision of professor Kwon Moosik and associate professor Nguyen Ngoc Tuan, we are working on full gene of prion .

===) we want to work ...


As the first step of prion study,

===) nói vậy có nghĩa là bạn là người đầu tiên của TG nc về prion ư, sửa là "our prion study"


we are going to clone full gene of prion encoding bovine prion protein from Korean bovine.

===) dùng going to kô sai, nhưng nên dùng từ khác ?nhấn mạnh hơn như reach, attempt, ... Và trả lời tại sao lại fulll lenght mà kô là partial?

PrP gene is cloned from cDNA of Korean bovine genome by PCR with a pair of forward & backward primers (Figure 2).

câu này có thể triển khai thành 1 đoạn: how can you designe primers??? Và chắc là bạn chỉ dùng 1 cặp primer ? hay có khi dùng nhiều cặp???

Lỗi ngữ pháp: tại sao lại là "is cloned" bạn đã làm chưa hay dự định làm???


Cloned gene is then transmitted in to pGEMT easy vector.

Vector chỉ là công cụ, cái chính là chuyển vô E.coli dưới kia kìa.



Subsequently ?recombination vector is transformed into E.coli and after that recombinant vector is sequenced.

===) tại sao lại đưa vào E.coli mà kô đưa vào các dòng tb khác? Đọc trình tự để làm gì? nếu kô đưa vô E.coli mà vẫn đọc trình tự thì sao? có được kô, có chấp nhận kết quả kô (tui đọc trình tự gene mà kô cần đưa vô vector)


After successful cloning, we change FR to expression vector.

===) more detail???

Protein productS will then be studied.

=== )bạn định nc cái gì???
 
Trần Hoàng Dũng said:
. Riêng phần working-plan thì quá sơ lược, ít ra nên triển khai bằng hoặc dài hơn đoạn introduction. Lỗi câu cú chữ nghĩa cho đoạn này không ít

Cám ơn anh đã sửa giùm. Em đã viết lại phần working-plan. Phần này em viết ngắn là do ở đây nó thế, mọi đề tài ở đây chỉ giới thiều sơ lược từ 7-10 dòng thôi.

Các lỗi anh chỉ em đã sửa. Anh xem lại


In this study, we want to work on full gene of prion . As the first step of our prion study, we were attempted cloning full gene of prion encoding bovine prion protein from Korean bovine.
PrP gene was cloned from cDNA of Korean bovine genome by PCR following 2 primers forward and reverses primer (Figure 2). Cloning of the recombinant PrP of full sequence cDNA is 651bp long encoding 217 amino acids. Cloned gene was then transmitted in to pGEM-T easy vector. Subsequently, recombination vector was transformed into E.coli. Recombinant plasmid of PrP was then further analyzed through sequencing.
 
Re: GENE CLONING PRION (PrP) FROM KOREAN BOVINE

Đặng Quốc Bảo said:
GENE CLONING PRION (PrP) FROM KOREAN BOVINE

Đặng Quốc Bảo

A prion — short for proteinaceous infectious particle — is a unique type of infectious agent, as it is made only of protein. Prion diseases, also called Transmissible Spongiform Encephalopathies(TSE), are  neurodengenerative diseases that affect ether animal or human.Some of diseases is decribled in Table 1.  (Prusiner,1998).

In mammals, a normal prion protein (PrPc) is a normal cellular protein that is expressed in the neurons and glia of the brain and spinal cord, as well as in several peripheral tissues and leukocyte.

PrPc also has some charecteristic still unknown.( Kang et al 2004). PrP play a central role in the transmission and pathogenesis of prion disease, but the abnormal isoform is an essential component of the prion particle (Prusiner, 1991).  Although PrPc and PrPsc have the same amino acid sequence, they are different in structural conformation. PrPc can be changed into the disease-causing isoform(PrPsc)  so the key to understanding the pathogenesis of this disease is the conformatinal conversion from PrPc( cell surface glycoprotein)  to pathogenesis isoform PrPsc.  PrPc is rich in α- helical (about 40%) content and has little β-sheet structure, whereas PrPsc has less α- helical (about 30%) content and high β-sheet(about 45%) structure(Pan et al. 1993; Pergami, P., Jaffe, H. & Safar, J. 1996). This difference in secondary structure makes the sensitivity to proteinase K (PK), and solubility are different( Corsaro et al,2002)

Bovine spongiform encephalopathy (BSE) is one of the most notable prion diseases. After infecting into bovine, the average time for BSE incubating is about 5 years. Therefore the disaster was not recognized until BSE infected more than 160,000 cattle, primarily dairy cows over 1980s (Anderson et al. 1996). Some study showed that BSE is a massive common-source epidemic caused by meat and bone meal(MBM) fed primarily to dairy cows(Nathanson et al. 1997; Wilesmith et al. 1991). The MBM was prepared from the offal of sheep, cattle, pigs, and chickens as a high-protein nutritional supplement.

BSE is not only potential risk on bovine but also on human. Believed related to BSE,  variant Creutzfeldt-Jakob disease (vCJD) was first reported in March 1996 in the UK.  In contrast to the classical forms of CJD, vCJD has affected younger patients (average age 29 years, as opposed to 65 years), has a relatively longer duration of illness (median of 14 months as opposed to 4.5 months) and is strongly linked to exposure, probably through food, to BSE. Similarities observed between the strain of the agent responsible for vCJD and those of BSE and closely related agents transmitted naturally and experimentally to different animal species, are consistent with the hypothesis discussed during two 1996 WHO consultations: that the cluster of vCJD cases is due to the same agent that caused BSE in cattle.  (WHO, 2002)

After the first outbreak in England in 1986, BSE spread throughout only Europe up to 2000. However, since 2001, it is spreading to counntries such as Japan (2001), Israel (2002), Canada (2003), and the United States (case found in Canadian cattle in 2003. OIE classifies the US as a BSE- free country). There were a total of 189,000 outbreaks in 23 countries (excluding the US) up to February 2005. Until now Korea is free from BSE (Tae-Yung Kim et. al,2005), but the BSE is high  risk damage society. The study on BSE is absolutelly essential.

In this study under the instruction of professor Kwon Moosik and associate professor Nguyen Ngoc Tuan, we are working on full gene of prion . As the first step of prion research, we are cloned full gene of prion encoding bovine prion protein from Korean bovine.
PrP gene is cloned from cDNA of Korean bovine genome by PCR following 2 primers forward and reverses primer (Figure 2). Cloned gene is transmitted in to pGEMT easy vector. Recombination vector is transformed into E.coli. Recombinant vector is sequenced.
 After successful cloning, we change FR to expression vector. Protein that collected will be studied.

Có vài lời góp ý thế này:

Mình thấy phần introduction này hơi ngắn. Và chưa bật được ý mà Bảo muốn người khác hiểu. Nếu mình là người ngoài ngành của Bảo, đọc nó, sẽ thấy rất ..loạn.

- Thời thì dùng chưa chuản ở một số chỗ, hay lỗi chính tả (ví dụ chữ mình tô màu đỏ ý). Những từ viết tắt phải được giả thích ngay từ đầu, chứ ko phải đến tận giưa giứa mới nói thi.. ko ai hiểu cả.

-Một câu hỏi mà mình muốn hỏi bảo là: TẠI SAO NGƯỜI ĐỌC LẠI PHẢI ĐỌC BÀI report NÀY CỦA BẢO??? Cái gì là cái Bảo muốn giới thiệu với người đọc.. ví dụ: nếu Bảo muốn đề cập đến prion, em phải chỉ cho người đọc thấy Prion quan trọng va trong project này em nghiên cứu về nó. Sau đó là protein ABC nao đó được dùng/nghiên cứu... Em phải chỉ cho người đọc thấy RÕ điều đó', chứ ko phải đưa ra những định nghĩa.. là thôi... Đang nói về PrPC, Bảo lai nói về BSE.. nó liên quan gì đến PrPC... Bảo chưa kết nối được chúng với nhau, và làm cho người đọc phải đi... đoán mò..

- Về phần working plan thì đúng như anh Dũng nói.. sơ sài quá... Bảo phải nhấn mạnh vào những ý sau:
+ Có những nhóm nào nghiên cưu về đề tài giống Bảo đang làm.. Nó connect thế nào với đề tài của Bảo. Họ làm thế nào? Tại sao nó vẫn còn nhuộc điểm khiên Bảo phải làm đề tài này.
+ Bảo giải quyết cái gì..
+ Bằng cách nào?
+ Kết quả ra sao?
+ ect

- Tốt nhất là viết bằng ngôn ngữ của mình, ko chơi trò copy and paste... VÀ viết câu càng ngắn gọn, càng tốt. Nhiều câu ở đây, Bảo viết dài quá, những tù như BUT, SO.. nghe cứ như văn nói, văn viết thì sẽ thay bằng however, nevertheless...

Góp ý cho Bảo, để nhìn lại bài mình viết... Mong được sự góp ý của anh chị.
 
Rất có thể ở trường của Bảo, đề cương Nc chỉ có thế. Tuy thế câu hỏi quan trọng nhất là; nc protein prion trong nc này để làm gì, nc cái gì, trả lời câu hỏi nào của vấn đề prion. Nếu chỉ đơn giản khuếch đại, dòng hóa vào vector, biến nạp, thu protein là xong. mà cái chính là thu protein rồi làm gì nữa.


Nếu đây là đề tài Master thì có thể tạm chấp nhận được, như vậy "việc nghiên cứu" của Bảo là:

- khảo sát chọn lựa cặp mồi tối ưu để khuếch đại gene prion

- khảo sát các điều kiện khác nhau để dòng hóa vào vectotr tối ưu

- khảo sát ....

- khảo sát ...

như vậy cuối cùng Bảo báo cáo ?là: à, tui đã sản xuất một lượng protein prion bằng pp dòng hóa để làm vật liệu cho các nc về sau. Chấm hết.

Nhưng nếu làm TS thì khác, toàn bộ phần trên chỉ là ... bước đệm để sau khi thu protein prion xong Bảo sẽ làm gì với nó???? Nc bệnh lý, nc cấu trúc, nc hoạt tính, nc tìm chất đối kháng diệt nó, ...
 
Trần Hoàng Dũng said:
Rất có thể ở trường của Bảo, đề cương Nc chỉ có thế. Tuy thế câu hỏi quan trọng nhất là; nc protein prion trong nc này để làm gì, nc cái gì, trả lời câu hỏi nào của vấn đề prion. Nếu chỉ đơn giản khuếch đại, dòng hóa vào vector, biến nạp, thu protein là xong. mà cái chính là thu protein rồi làm gì nữa.


Nếu đây là đề tài Master thì có thể tạm chấp nhận được, như vậy "việc nghiên cứu" của Bảo là:

- khảo sát chọn lựa cặp mồi tối ưu để khuếch đại gene prion

- khảo sát các điều kiện khác nhau để dòng hóa vào vectotr tối ưu

- khảo sát ....

- khảo sát ...

như vậy cuối cùng Bảo báo cáo  là: à, tui đã sản xuất một lượng protein prion bằng pp dòng hóa để làm vật liệu cho các nc về sau. Chấm hết.

Nhưng nếu làm TS thì khác, toàn bộ phần trên chỉ là ... bước đệm để sau khi thu protein prion xong Bảo sẽ làm gì với nó???? Nc bệnh lý, nc cấu trúc, nc hoạt tính, nc tìm chất đối kháng diệt nó, ...

- Em đồng ý với anh Dũng. Nếu là cho Master, với đề tài khoảng 6 tháng đến 1 năm thì được.

-Câu hỏi quan trọng nhất mà anh Dũng đề cập, Bảo nên lắng nghe... Em cần đưa nó vào trong introduction (hay ở đây là description nhỉ?) của mình. Bao giở cái "aim of the study" cũng là cái đáng đọc nhất.. Em có thể chỉ ra là cái đích cuốii cùng của toàn bộ project của em là hướng tới cái gì... Và trong nghiên cứu của em, những cái sau đây sẽ được khảo sát: A, B, C...

@ anh Dũng: hình như thu protein xong sẽ đến bước test protein ấy.. ko biết có đúng ko ạ? Mà test xong thì một thesis cho Master là ổn rồi ạ. Sau đó mới bắt tay vào những mảng sau anh Dũng đề cập...
 
đúng là tên đề tài của Bảo có nói là chỉ tạ dòng gene mã hóa prion, chứ kô đề cập đến bất kỳ chuyện nc nào về cái protein này, vậy việc này làm trong Master thesis là hợp lý.

Và nữa, điều hiển nhiên là sau khi có protein prion xong người ta sẽ nc về nó (theo mấy hướng mà tui có gợi ý).

Đúng là Bảo nên thêm phần Aim of Study: ví dụ chỉ cần 1 cầu thôi_ chúng tôi hướng tôi tạo ra vector có chứa gene mã hóa protein để sản xuất prion trong phòng tn cho các nc về sau.

Và như thế trong phần introduction sẽ chỉnh sửa và bổ sung rằng:

- trên tg có nhiều hướng nc prion

- nhưng phần lớn chỉ thu prion trực tiếp từ bệnh phẩm nên việc phân tách thu số prion  ở số lượng lớn thường kô hiệu quả, phức tạp, tốn kém và không an toàn.

nếu cần thì thêm vô rằng: Ông A bà B chị C nào đó cũng đã thử sx prion phòng tn bằng pp X, Y, Z nào đó ( nhưng còn khuyết điểm 1, 2, 3 gì đó ... phải trích dẫn đàng hoàng)

- chúng tôi bước đầu muốn sản xuất prion bằng kỹ thuật dòng hóa để tìm cách thu nhận lượng prion đủ lớn cho các nc về sau và khắc phục các khuyết điểm 1,2,3 gì gì đó.

Còn việc test protein tức là test hoạt tính sinh học thì tùy  từng đối tượng protein, protein dễ làm, nhiều pp có sẵn thì làm nhanh, có khi 1 Master kà đủ, còn cái nào phức cta5p ít nc thì lâu. Tôi dự đoán với prion thì cần vài Ph.D mới test được vì:

- prion này là yếu tố gây bệnh tức là phải coi khi tiêm prion nhân tạo vào bò, nó có phát bệnh không hay tối hiểu là gây nhiễm trên mô não; cái này có thể đưa cho dân thú ý làm sẽ tốt hơn dân sinh chính gốc.

- các kỹ thuật nc đặc hiệu cho prion chưa có nhiều, nên người làm sẽ vừa làm vừa mò mẫm, mọi thành công trong bước mò  mẫm này đếu có giá trị cao. Do mò mẫm nên sẽ làm rất lâu.
 
Mới đi gene camp về! Đọc tin offline nghe thằng bạn nó nói là có người nói mày đang làm đề tài Mastervội lên cải ? chính.
? Hic mấy bác không để ý cái chữ sinh viên to đùng của em ạ!
?Thật ra thì em chả hứng thú gì với cái full gene này đâu. Mục tiêu của em lúc đầu là cloning một đoạn 220bp (full gene khoảng 650bp). Sau vài chục lần clone và vài lần giải mã kết quả vẫn không được đoạn gene mong muốn. Lúc đầu còn định làm expression cái đoạn này luôn kia, nhưng càng làm càng không ra nên giáo sư bắt viết full gene cho dễ :o .
?Cám ơn các góp ý của các bác. Em sẽ cố gắng sửa chữa cho hoàn chỉnh. Tuần sau em sẽ post materials and methods mong được các bác chỉ giáo tiếp.
 
II. MATERIALS AND METHODS
1. PCR primers
PCR primers were used in a PCR to amplify fragment PrP from gDNA. Specific primers used to amplify the PrP gene fragments are shown in figure 2.

2. PrP gene was cloned from cDNA of Korean bovine genome by PCR
For cloning of the PrP gene, Polymerase Chain Reactions (PCR) were performed, using specific primer. The reaction mixtures (10μl) for PCR contained 10pM forward and reverse primers; 100ng of ?gDNA; 0.4mM dNTPs; 10x PCR buffer, 5unit of Super Taq DNA polymerase (Super-Bio, Co., Seoul, Korea); 25mM MgSO4.
Standardizing PCR was made by gradient PCR with annealing temperature form 55oC - 64oC. The amplification reaction included 1 cycle at 95oC for 3 min, following 30 cycles of thermal profiles; denaturizing at 94oC for 45sec, annealing at 58oC for 30sec, and extending 72oC for 30sec; and finally 1 cycle at 72oC for 3 min.

3. Agarose gel electrophoresis to separate PrP gene
3.1 Confirm PCR product
The PCR products were analyzed by electrophoresis on a 0.8% agarose gel. The mixture of template included 5μl template, 1μl 6X loading buffer and the 1Kb DNA ladder (GeneRulerTM, Fermentas, Co.) was used. The electrophoresis condition is 100V in 30 minutes. The gel then was stained by ethidium bromide (EtBr) staining by slow shacking in 30 minutes. The PCR products were explored by UV lamp.
3.2 Elution gel
0.8% agarose gel had been added 2.5μl EtBr while it was cooling down. After loading DNA sample in 6X loading buffer and ladder, electrophoresis is carry out in 1X TAE buffer at 80V in 10 minutes and 120V in 25 minutes.

4. Extract and purify DNA by QIAquick Gel Extraction Kit
DNA fragment are separated by electrophoresis. Under UV lamp, desired DNA fragment was extract from the agarose gel with a sharp as thin as possible.
Subsequence, the gel slice was eluted by using the QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagene).
To verify the success of elution, the mixture of 2μl elution product, 3μl 1X TAE buffer and 1μl 6X loading buffer was loaded on 0.8% agarose gel with a corresponding ladder marker.

5. Ligation
Ligation of DNA fragment into pGEM-T easy vector (Promega Co., Madison, WI, U.S.A.) was carried out using T4 ligase (Promega). The mixture contains 1μl pGEM T easy vector, 4μl insert DNA, 5μl 2X buffer, 1μl ligase(T4).
The reaction was run on 16oC in 1hour or 4oC overnight. 2μl of ligased material was checked by 0.8% agarose gel electrophoresis and the rest one used for transformation into E. coli
 
Thường thì phần Protocol không cần nêu lên trong bài. Tuy nhiên với đề tài tốt nghiệp thì có thể mang vào cho dài thêm một chút không mong các bác cho ý kiến!
 
em đã làm đề tài chưa hay chuẩn bị làm mà đề cương của em chia QUÁ KHỨ tùm lum vậy?

à, sẵn tiện tui chỉ em kinh nghiệm khi em tách PCR product bằng QIAgene kit hay bất kỳ bộ kít nào đó là khi em cho buffer (quên tên rồi) vô PCR product (thường tỷ lệ 3:1 hay 5:1 gì đó) em ủ trong đá chừng 5-10 phút rồi, bước này giúp tủa DNA thội chứ chẳng có gì ầm ĩ; sau đó em cho nguyên hỗn hợp vô colume và ly tâm. Theo protocol nó xúi em thì em nên vứt cái flow-thought đi vì DNA nó bám lên màng rồi. Nhưng đừng có dại dột, PCR product còn đầy nhóc trong cái flow-thought đấy. Tui lấy flow-thought cho vào Eppendoft 2 ml và trữ lạngh -20 độ C, lần sau khi tui hết DNA tui rã động và thu tiếp DNA.

kế nữa là sau khi em rửa colume bằng washing buffer rồi thì em nên để colume ?ở nhiệt độ phòng chừng 10-20 phút để cồn bay hơi hoàn toàn rồi hãy cho elution buffer vô, em có thể dùng mũi ngửi coi còn mùi cồn không. vì nếu còn cồn, em sẽ thu DNA rất ít.
 
Lỗi chung của em là đặt tiêu đề kô có logic



II. MATERIALS AND METHODS
1. PCR primers



PCR primers were used in a PCR to amplify fragment PrP from gDNA. Specific primers used to amplify the PrP gene fragments are shown in figure 2.

===)Câu tiếng Anh gì kỳ vậy em? Gom 2 câu này làm một.

Thiết kế primers.

Primers dùng để khuyếch đại gene ABC được thiết kế dựa trên EFHG gì đó có trình tự là DJHDJHDJH và được đặt hàng tại công ty ZTH nào đó, hình 123 mô tả vị trí tương đối vị trí bắt cặp primers



2. PrP gene was cloned from cDNA of Korean bovine genome by PCR


For cloning of the PrP gene, Polymerase Chain Reactions (PCR) were performed, using specific primer. The reaction mixtures (10μl) for PCR contained 10pM forward and reverse primers; 100ng of  gDNA; 0.4mM dNTPs; 10x PCR buffer, 5unit of Super Taq DNA polymerase (Super-Bio, Co., Seoul, Korea); 25mM MgSO4.



Standardizing PCR was made by gradient PCR with annealing temperature form 55oC - 64oC. The amplification reaction included 1 cycle at 95oC for 3 min, following 30 cycles of thermal profiles; denaturizing at 94oC for 45sec, annealing at 58oC for 30sec, and extending 72oC for 30sec; and finally 1 cycle at 72oC for 3 min.


=====) cái này là khuyếch đại hay tạo dòng???Amplification or clone????

Gene ABC được khuyếch đại bằng kỹ thuật PCR có các thông số chu kỳ như sau: sjdbkjsgkjsbv


3. Agarose gel electrophoresis to separate PrP gene
3.1 Confirm PCR product
The PCR products were analyzed by electrophoresis on a 0.8% agarose gel. The mixture of template included 5μl template, 1μl 6X loading buffer and the 1Kb DNA ladder (GeneRulerTM, Fermentas, Co.) was used. The electrophoresis condition is 100V in 30 minutes. The gel then was stained by ethidium bromide (EtBr) staining by slow shacking in 30 minutes. The PCR products were explored by UV lamp.
3.2 Elution gel
0.8% agarose gel had been added 2.5μl EtBr while it was cooling down. After loading DNA sample in 6X loading buffer and ladder, electrophoresis is carry out in 1X TAE buffer at 80V in 10 minutes and 120V in 25 minutes.



hai đoạn này chỉ khác nhau ở chỗ là nhuộm gel sau khi chạy diện di và cho EtBr trước khi chạy gel, tại sao phải rắc rối vậy???Tựa đề là Elution gel, có thấy gì đâu?




4. Extract and purify DNA by QIAquick Gel Extraction Kit


===) Tựa đề chỉ cần ghi là Extract and purify DNA, còn cái bộ kít thì ghi ở dưới



DNA fragment are separated by electrophoresis. Under UV lamp, desired DNA fragment was extract from the agarose gel with a sharp as thin as possible.
Subsequence, the gel slice was eluted by using the QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagene) THEO HUONG DAN CUA NHA SAN XUAT.

To verify the success of elution, the mixture of 2μl elution product, 3μl 1X TAE buffer and 1μl 6X loading buffer was loaded on 0.8% agarose gel with a corresponding ladder marker.

5. Ligation
Ligation of DNA fragment into pGEM-T easy vector (Promega Co., Madison, WI, U.S.A.) was carried out using T4 ligase (Promega). The mixture contains 1μl pGEM T easy vector, 4μl insert DNA, 5μl 2X buffer, 1μl ligase(T4).

DNA concentration of 4μl insert DNA???

The reaction was run on 16oC in 1hour or 4oC overnight. 2μl of ligased material was checked by 0.8% agarose gel electrophoresis and the rest one used for transformation into E. coli
 
Trần Hoàng Dũng said:
à, sẵn tiện tui chỉ em kinh nghiệm khi em tách PCR product bằng QIAgene kit hay bất kỳ bộ kít nào đó là khi em cho buffer (quên tên rồi) vô PCR product (thường tỷ lệ 3:1 hay 5:1 gì đó) em ủ trong đá chừng 5-10 phút rồi, bước này giúp tủa DNA thội chứ chẳng có gì ầm ĩ; sau đó em cho nguyên hỗn hợp vô colume và ly tâm. Theo protocol nó xúi em thì em nên vứt cái flow-thought đi vì DNA nó bám lên màng rồi. Nhưng đừng có dại dột, PCR product còn đầy nhóc trong cái flow-thought đấy. Tui lấy flow-thought cho vào Eppendoft 2 ml và trữ lạngh -20 độ C, lần sau khi tui hết DNA tui rã động và thu tiếp DNA.

kế nữa là sau khi em rửa colume bằng washing buffer rồi thì em nên để colume  ở nhiệt độ phòng chừng 10-20 phút để cồn bay hơi hoàn toàn rồi hãy cho elution buffer vô, em có thể dùng mũi ngửi coi còn mùi cồn không. vì nếu còn cồn, em sẽ thu DNA rất ít.

?Anh quên tên cái buffer đó nên em cũng chả biết nó nằm ở bước nào? Vì tỉ lệ 3:1 là QG mà cái này để làm tan gel ở 50 độ nên chắc khôg phải.
?Chắc là bước cho isopropanol(tỉ lệ thường là 1:1) để kết tủa DNA.
 
thì chính cái buffer làm tủa PCR product chứ đâu.

01- Nếu em dùng để tách PCR từ gel, thì sau khi cắt gel, cho vào viral, em cho buffer tương ứng, đun cách thủy 55 độ C, rồi cho vào column.

02- Nếu em tách PCR trực tiếp sau khi chạy PCR thì em cho buffer vào PCR products (tỷ lệ 5:1) rồi ủ nhẹ trong đá chừng 5 phút, cũng cho vào column.

Trong cả hai trường hợp, PCR sẽ bám lên màng của column, em ly tâm và bỏ dịch flow-through; sau đó mới rửa column và lấy lại DNA. Nhưng thực tế hiệu xuất giữ DNA của màng column kô cao nên phần lớn (tren 50%) DNA còn lưu lại trong dịch flow-through. Do đó rút kinh nghiệm xương máu, tui luôn trữ lạnh (-20 độ C) cái dịch này, khi hết PCR thì lấy nó ra, rã đông, cho vào column và thu tiếp PCR.
 

Similar threads

Facebook

Top